釉质上皮型颅咽管瘤患者血浆及脑脊液中Hsp90α 的表达

陈拓宇 栗琳 赵忙所 薛超强 张玉琪

釉质上皮型颅咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma，ACP）是临床最常见的颅咽管瘤类型，儿童大多都是ACP，而成人约1/6 为鳞状乳头型颅咽管瘤（squamous papillary craniopharyngioma，SPCP），其余为ACP[1]。临床上ACP 的生物学特性导致其手术难度大、并发症多，术后复发率高。因此，ACP 是否具有侵袭性一直是研究的热点，国内外学者都在试图探寻一种能判断ACP 侵袭性强弱或可随访的指标。热休克蛋白90α（heat shock protein 90α，Hsp90α）是近年来发现的一种能界定肿瘤侵袭性强弱的标志物，已通过血浆检测，在肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤患者体内被检测确定，但对中枢神经系统原发肿瘤的研究还是空白[2]。本研究主要运用ELISA 法，定量检测、分析患者血浆及脑脊液中Hsp90α 含量的差异，结合Western blot 法血浆检测结果与病理诊断，研究ACP 是否具有侵袭性及其侵袭性强弱，现报道如下。

资料与方法

一、分组及入组标准

选取自2014 年7 月至2015 年10 月清华大学玉泉医院神经外科手术治疗的患者为研究对象，分为4 组，其中3 组为颅内肿瘤患者[ACP 组、胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）组、脉络丛乳头状瘤（choroid plexus papilloma，CPP）组]，1 组为颅骨修补患者。（1）颅内肿瘤患者均需经术后病理学确诊，为WHO Ⅰ级的ACP 或WHO Ⅳ级的GBM 或WHO Ⅰ级的典型CPP。排除不能承受或拒绝行腰椎穿刺留取脑脊液的患者；是否为首发肿瘤未设要求。（2）颅骨缺损对照组：患者为外伤后行去骨瓣减压术后行颅骨修补的患者，无脑内器质性病变，骨瓣减压术后≥3个月，伤口已完全愈合，无感染、炎症、出血、脑水肿或脑积水等；术前血浆C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）在正常范围内。（3）所有患者的年龄、性别均不限。（4）本研究方案提请医院医学道德委员会审查并通过，患者或其家属签署知情同意书。

二、一般资料

纳入患者32 例。ACP 组患者14 例，其中男性8例，女性6 例；年龄范围5～53 岁，平均17.7 岁；首发ACP 7 例，复发ACP 7 例（3 例经过放疗后复发）。GBM 组患者6 例，男性3 例，女性3 例，年龄范围49～76 岁，平均60.5 岁，其中首发GBM 5 例，复发GBM 1 例（经过化疗后近半年再次复发）。CPP 组患者6 例，男性4 例，女性2 例，年龄范围5 个月～4岁，平均19 个月，均为首发肿瘤。颅骨缺损对照组患者6 例，其中男性4 例，女性2 例，年龄范围3～12岁，平均8.3 岁；颅骨缺损均为外伤所致，其中3 例车祸伤，2 例坠落伤，1 例钝器伤；受伤时间最短4 个月，最长3 年，平均1 年9 个月。

三、标本采集

（1）血浆标本：入组患者均在清晨未进食状态下用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管采集10 mL 静脉血，并尽快在低温条件下送至实验室离心（4℃、1300 g、10 min），取上层血浆备用。（2）脑脊液标本：为避免术中留取脑脊液时误将血浆成分混入脑脊液，均采用全身麻醉后，于开颅前在手术台上行腰椎穿刺术留取脑脊液10 mL，余步骤同前。

四、血浆及脑脊液Hsp90α 含量测量

用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 法）实验定量测量上述4 组患者的血浆及脑脊液Hsp90α 含量。血浆样本高速离心（4℃、14 000 g、10 min）后取上清100 μL，脑脊液以同样方法取100 μL，用于Hsp90α 定量检测试剂盒（烟台普罗吉生物发展有限公司）的检测，检测步骤严格遵从试剂盒使用说明书。ELISA 样本检测通过跟试剂盒内自带的5 个浓度样本所作出的标准曲线作对比，用酶标仪进行读数。

五、Western blot 测定血浆中Hsp90α 和Actin蛋白的含量

采用蛋白免疫印迹法（Western blot 法）检测上述患者血浆中Hsp90α 和Actin 蛋白的含量，用以辅证ELISA 结果。7 mol/L 尿素萃取液以4∶1 的比例加入临床样本中，混匀震荡，用于蛋白萃取。离心后取上清1 μL，用bradford 法测定其蛋白含量。定量后将50 μg 蛋白于10%的SDS-PAGE 凝胶电泳，分离蛋白，之后转至孔径为0.45 nm 的PVDF 膜上，并用脱脂牛奶封闭2 h（常温）。一抗分别是鼠抗人Hsp90α（Abcam 公司，英国）1∶1000 稀释和鼠抗人Actin（Sigma 公司，美国）1∶1000 稀释，37℃孵育4 h，之后用TBST 洗3 次，每次10 min，之后加入兔抗鼠二抗（Sigma 公司，美国），室温孵育1 h，经Odesssy曝光仪自动生成Western blot 中各条带的相对灰度值，并利用其自带软件将灰度值转化为柱状图，并自动计算每组样本的平均值及标准差。

六、病理学检查

术中切除的肿瘤标本均在2 h 内固定于4%多聚甲醛过夜，石蜡包埋后切片，进行HE 染色，肉眼光学显微镜下判读，再由免疫组织化学定性诊断。入组的颅咽管瘤必须是ACP，并为WHO Ⅰ级；胶质瘤必须是GBM，并为WHO Ⅳ级；脉络丛肿瘤必须是CPP，且为WHO Ⅰ级。复发ACP 患者增加对肿瘤外层边界的病理切片、HE 染色，观察其对周围脑组织的浸润程度。

七、统计学分析

运用SPSS19.0 软件进行数据统计学分析，各组数据进行Kolmogorov-Smirnov（K-S）正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，4 组间比较采用方差分析，两两比较采用多重比较，原发和复发ACP 患者Hsp90α 含量的对比采用t 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结果

一、ELISA 法检测4 组患者血浆和脑脊液中Hsp90α 的含量

所有入组患者体内均能产生一定量的Hsp90α，其能通过血-脑屏障、血-脑脊液屏障等生理屏障等进入外周血液循环中而被检测出来。颅内肿瘤患者无论是血浆还是脑脊液中的Hsp90α 水平均远高于颅骨缺损对照组患者，差异均具有统计学意义（P＜0.05，表1）。血浆中Hsp90α 含量高低：GBM 组＞ACP组＞CPP 组=颅骨缺损对照组；脑脊液中Hsp90α 含量高低：GBM 组＞ACP 组＞CPP 组=颅骨缺损对照组（图1A～B）。复发ACP 患者血浆中Hsp90α 含量水平显著高于原发ACP 患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），而脑脊液中的Hsp90α 含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图1C～D）。

表1 4 组患者血浆和脑脊液中Hsp90α 蛋白的含量（ng/mL，Mean±SD）

二、Western blot 法血浆验证结果

观察各组患者的Western blot 在90 000 上的灰度值直观上即有一定区别（图2A）。经Odesssy 曝光仪利用其自带软件将灰度值转化为柱状图，在排除样本数干扰的前提下，入组颅内肿瘤（ACP、GBM 及CPP）患者血浆中的Hsp90α 水平均高于作为颅骨缺损对照组（图2B）。

三、病理结果

术后病理诊断证实ACP、GBM 和CPP 的肿瘤分型及WHO 分级。ACP 病理结果显示典型肿瘤外膜附近的组织结构，除可见ACP 浸润邻近组织时引起的胶质细胞反应增生带（Rosenthal 纤维）外，还可见肿瘤向外“侵袭”的迹象，即可见ACP 最外层拥有多尖边缘和不规则突起形状，呈“舌样”或“岛样”，正在突破肿瘤基膜，侵犯周围正常组织（图3）。

讨论

颅咽管瘤属于先天性的上皮成分起源肿瘤，一直被认为是“纯”良性肿瘤。在WHO 中枢神经系统肿瘤分类中，颅咽管瘤的两个病理亚型（ACP 和SPCP）均被定为WHO Ⅰ级[3-5]。GBM 是颅内最常见的原发恶性肿瘤，为WHO Ⅳ级，其约占颅内肿瘤的12%～15%[5]。典型的CPP 为起源于脑室内脉络丛上皮细胞的良性肿瘤，为WHO Ⅰ级，约占儿童颅内肿瘤的2%～4%[6]。因此CPP 和GBM 可代表最典型的良/恶性肿瘤。本研究中将ACP 与最典型的良/恶性肿瘤进行研究对照，能对其生物学性质，特别是侵袭性有深入了解。

图1 4 组患者血浆和脑脊液Hsp90α 含量ELISA 检测

图2 4 组患者血浆中Hsp90α 蛋白Western blot 检测结果

图3 复发的造釉细胞型颅咽管瘤病理资料（HE 染色，×100）

肿瘤侵袭也称肿瘤浸润，是指肿瘤细胞突破外层基底膜并向四周正常组织浸润性生长、侵犯的过程。临床上ACP 常表现出对下丘脑、视神经、垂体柄等重要结构侵袭性生长的生物学行为，预后明显较差。但侵袭性颅咽管瘤这一称呼至今在国际上并没得到正式承认，只是部分ACP 在电子显微镜下能证实其肿瘤细胞能呈“岛样”、“手指状”、“舌头样”等聚集，突破肿瘤基膜，侵入周围正常脑组织中，且肿瘤外周具有纤维胶质组织（即Rosenthal 纤维）环绕，因此部分病理学家才称之为侵袭性颅咽管瘤[7]。目前颅咽管瘤是否具有侵袭性只有术后病理诊断才能确认，对临床手术无指导意义。因此，探索一种兼顾“预判”及“随访”功能，并指导手术的检验指标就成了本研究的目的。此检验指标应具有以下特点：（1）标本取材尽量对患者创伤小、痛苦少；（2）取材操作简便易行，可普及；（3）检验硬件要求一般，过程耗时少、价格低；（4）检验结果通俗易懂、可量化。

Hsp90α 是机体细胞中普遍存在的一种蛋白质，其主要作用是维持细胞新陈代谢，促进细胞生长与增殖[8]。在病理或应激条件下正常细胞可向外分泌超量的Hsp90α，通过毛细血管网或毛细淋巴管进入血浆循环，使之能在血浆中被检测出来[9]。研究表明，Hsp90α 可在应激状态下表达于正常的神经细胞、皮肤鳞状上皮细胞或血浆中的免疫细胞的细胞膜表面[10,11]。肿瘤的产生、发展对于正常机体来说也是一种应激状态。有研究表明，在肿瘤细胞中，突变或异常蛋白可刺激Hsp90α 的高表达，达正常水平的2～10 倍以上，同时Hsp90α 还能正反馈的加速肿瘤细胞的恶性转归[12]。国内有学者发现，Hsp90α 在不同分化程度胃癌中的表达程度不同，在中、高度分化胃癌中的表达较低分化胃癌中的表达明显（P＜0.05）；而印戒细胞癌中的表达明显低于中高分化癌和低分化癌（P＜0.05）[13]。Pick 等[14]的研究表明，乳腺癌中Hsp90α 高表达跟患者术后生存时间有明显关系。Wang 等[15]研究直接指出Hsp90α 的表达高低预示着胃癌的侵袭程度，指导着患者预后。

目前，尚无学者直接从血浆及脑脊液中提取Hsp90α，通过测量其表达，研究颅内原发肿瘤的良恶性或侵袭度。本研究在运用ELISA 法检测Hsp90α 时，均参照清华大学肿瘤分子实验室的研究经验，即正常人群血浆中Hsp90α 含量应＜50。这说明本研究取颅骨修补患者作为正常对照组应符合入组条件，而且使正常人群入组，无论是在抽血还是腰椎穿刺获取脑脊液都有技术或伦理学上的困难。

本研究中所有入组肿瘤患者（ACP、GBM）血浆及脑脊液中Hsp90α 含量均远高于颅骨缺损对照组。此结果也印证了颅内肿瘤，无论良性、恶性肿瘤，均对患者是一种“应激”状态，可使其体内高表达Hsp90α。在颅内肿瘤患者中，无论血浆还是脑脊液中的Hsp90α 含量，GBM 组＞ACP 组＞CPP 组=颅骨缺损对照组，这一结果或许可以说明ACP 侵犯/浸润周围正常组织的能力介于良性和恶性肿瘤之间，具有相当的侵袭性。笔者使用了Western blot 法对以上推测进行了验证，并通过Odesssy 自动曝光仪的自带软件生成柱状图，表明在不考虑病例数的情况下，ACP 血浆中Hsp90α 含量介于GBM 与CPP 之间，且远大于颅骨缺损对照组。但ACP 与CPP 同为WHO 分类中的Ⅰ级肿瘤，其差异可能由于Hsp90α的分泌水平与肿瘤的侵袭性正相关，与病理分级无明显关系。Hsp90α 在血浆、脑脊液中的含量越高，越能说明肿瘤对周围脑组织的浸润、侵袭程度越重。此结果印证了在实际手术操作中，ACP 因与周围正常脑组织黏连紧密而较同为WHOⅠ级的CPP 更难切除，且术后复发率高。

上述结果并没有将原发ACP 与复发ACP 进行分组对比，很难解释到底是原发肿瘤侵袭还是因肿瘤复发，或是手术损伤影响了Hsp90α 水平的高低。因此，在对原发、复发ACP 患者的血浆及脑脊液的ELISA 检测后，笔者发现复发ACP 中血浆Hsp90α水平明显高于原发患者。但是脑脊液结果差异不明显，可能原因有：（1）复发ACP 患者均做过手术，颅内血脑屏障等生理屏障无论从生理学还是解剖学上都不完整，肿瘤细胞与外周血液循环之间存在部分直捷通路可能；（2）复发ACP 常原位复发，多因原肿瘤与周围组织结构黏连不清，病理证实侵袭性生长的ACP 细胞本身会向周围脑组织浸润，突破基膜、破坏周围毛细血管内皮细胞。这样ACP 细胞便能直接向血液循环中分泌Hsp90α，使血浆内浓度相对高于脑脊液内浓度。

值得注意的是，在单独对比检测中，CPP 患者与颅骨修补患者血浆及脑脊液中Hsp90α 含量差异无统计学意义。笔者考虑为典型的CPP 生长方式多为脉络上皮细胞在脑室内异常增殖，几乎无核异型性，对周围脑组织及血管、神经基本无侵袭，手术难度主要体现对供血动脉及引流静脉的阻断及处理上，而且脉络丛上皮细胞的最主要生理作用为分泌脑脊液，因此CPP 细胞直接向脑脊液中分泌大量的Hsp90α 是造成患者脑脊液中Hsp90α 含量相对高于血浆的原因，但还有待进一步大样本实验的支持。本研究因实验设计原因未完成脑脊液的Western blot 检测，需要后续研究完善。

综上所述，探讨颅咽管瘤的侵袭性是挑战人们对此肿瘤的认知，而且本研究未从传统病理研究入手，而是创新性地直接从术前血浆及脑脊液检测入手，面临更大的挑战。在标本取样时，腰椎穿刺、静脉抽血、麻醉插管等操作对患者是一种“应激状态”，因此，机体细胞分泌的Hsp90α 对实验结果的影响有待进一步研究。对于ACP 患者术后Hsp90α 在血浆及脑脊液中的表达，或许能作为随访指标之一。