不同胁迫条件下白花三叶草种子的萌发特性

刘 伟，常 征，黄 勇

（文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099）

白花三叶草（Trifolium repensL），又名白三叶草、荷兰翘摇、菽草、白花苜蓿、白车轴草，为豆科三叶草属多年生常绿草本植物，广泛分布于温带及亚热带高海拔地区，在我国淮河以南和西南地区均有栽培。三叶草是优质牧草，茎叶细软，叶量丰富，粗蛋白含量高，粗纤维含量低，既可放养牲畜，又可饲喂草食性鱼类，具有良好的生态价值和经济效益。根部分蘖能力及再生能力均强，可以和菌根真菌形成良好的共生关系[1]。因其植株低矮，适应性强，被广泛用于机场、码头、高速公路、公园广场、街头绿地等场所，是优良的水土保持和城市园林绿化植物。种子的萌发状况是植物生长的关键步骤，在我国土壤酸化、土壤盐渍化和干旱地区，土壤pH值、盐胁迫、干旱胁迫等都是影响种子萌发的重要因素；研究不同胁迫条件下白花三叶草种子的萌发特性，对在具有相关逆境因素的区域推广利用该植物资源具有重要意义。我国对白花三叶草的研究较晚，从种子萌发、固土护坡效果、虫害、抗胁迫能力等方面的研究都有报道。王华军对三叶草的病虫害防治提了详细的具体措施[2]，高占军等研究得到盐胁迫对白三叶种子的发芽率、发芽势产生显著的影响；当NaCl浓度＜0.40%时白三叶幼苗和根的生长速度几乎不受影响，≥0.40%时受到抑制；白三叶幼苗体内游离脯氨酸、MDA和可溶性糖含量与盐度的上升呈正相关关系[3]，黄寿臣等[4]研究表明：AM真菌与白花三叶草形成共生关系后能够显著改善复合盐碱胁迫下白花三叶草的生长状况。安利佳在1992年研究了白花三叶草叶愈伤组织诱导和植株再生的方法和技术[5]；陈宝书对三叶草的起源、生物学特性、形态特征、栽培技术等做了比较深入的研究[6]；胡迪先对红三叶和白三叶的营养成分进行了分析[7]。本研究以种子萌发中经常遇到的土壤酸碱度、盐碱化和干旱胁迫3种条件下的萌发特性为切入点，通过试验，得到白花三叶草在三种不同胁迫条件下的萌发特性，为白花三叶草在盐碱化土壤或干旱条件下的推广利用积累资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年10月底在文山学院草坪收集白花三叶草种子，晒干后选取健壮、子粒饱满、完整的种子作为试验材料。试验前先用1%高锰酸钾溶液表面灭菌 10 min，再用蒸馏水冲洗3～4次。

1.2 实验方法

1.2.1 不同pH值对种子萌发影响的研究方法

先配制1 mol/L HCl和l mol/L NaOH，将培养溶液pH值调节成6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共5个梯度。将种子置于垫有滤纸的培养皿中并贴上标签，加入不同pH值溶液，处理后开始每天用胶头滴管滴加相应的pH溶液，使滤纸保持湿润，每2 d更换一次培养液和滤纸，每处理50粒种子，重复3次。将培养皿放在（25±1）℃、有自然光照的实验室里萌发，每天记录种子发芽数，以胚根露出种皮为萌发标准，观察记录后及时清除已萌发种子。

1.2.2 盐胁迫对种子萌发影响的研究方法

分别设置浓度为50、100、150 mmol/L的NaCl溶液，以蒸馏水培养作对照（CK），培养和处理方法同pH值溶液。

1.2.3 干旱胁迫对种子萌发影响的研究方法

用PEG6000配制干旱胁迫溶液，分别设置5%、10%、15%、20%、25%共5个浓度梯度，各处理均在（25±1）℃、自然光照的条件下进行，每个处理设置3次重复，每次重复50粒种子，以蒸馏水培养作对照（CK），种子的数量、萌发标准、培养方法和记录方法同上。

1.2.4 种子萌发指标的测定

发芽以胚根突破种皮，露白为发芽标志，每24 h定时记录种子萌发数。

发芽率（%）=试验时间内发芽种子总数/供试种子数×100%

发芽势（%）=发芽达到高峰时的发芽数/供试种子总数×100%

本试验发芽高峰期为发芽数最多的一天。

发芽指数（GI）＝ ∑（Gt/Dt），式中：Gt为 t时间内发芽数，Dt为发芽天数

平均发芽时间=∑（d）n/∑n，式中：d为开始试验日算起的天数，n为相应各天正常发芽粒数。

1.3 统计与分析

所有测量数据用Excel2016和Spss16.0软件进行处理，不同试验因素进行单因素方差分析，同一因素不同水平进行LSD多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同pH处理对白花三叶草种子萌发的影响

2.1.1 不同pH处理对白三叶草种子发芽率的影响

由表1可以看出，白三叶草种子在6.0和6.5时发芽率均达到92.67%，随着pH值的上升，发芽率呈现先下降后升高的趋势，发芽率都在86%以上。进行方差分析后显示组内和组间的发芽率没有显著性差异，种子的发芽率与CK无显著性差异，发芽率均可达到86.00%以上，说明白三叶草种子在萌发期对土壤酸碱性要求不严，都能正常萌发。

2.1.2 不同pH处理对白三叶草种子发芽势的影响

表1显示，pH为6.0时，种子的发芽势达到最大值（36.00%），pH为6.0～7.0时发芽势呈现先降低后升高的变化趋势，且在pH为6.5、7.5、8.0时达到最小值31.33%。这说明在pH=6时，白三叶草的发芽速度和整齐度都达最高，种子发芽快、出苗整齐。对数据进行方差分析可知，发芽势在组内和组间也没有显著性差异。

2.1.3 不同pH处理对白三叶草种子发芽指数的影响

由表1可看出，pH在6.0～7.0时，种子的发芽指数呈现逐渐下降的趋势；pH在7.0～8.0时，发芽指数随pH值升高呈先增加后降低的趋势，在pH6.0时达到最大值21.52，证明白三叶草种子生活力最强。对数据进行方差分析，各处理之间的发芽指数存在显著差异，之后进行多重比较，在pH7.0时发芽指数显著低于pH8.0，极显著低于pH6.0、6.5和7.5，说明在pH7.0的环境对白三叶草种子的活力具有明显的抑制作用。以上结果表明萌发环境的酸碱度对白三叶草种子的活力具有明显的影响。

2.1.4 不同pH处理对白三叶草种子平均发芽时间的影响

由表1可知，总体上看平均发芽时间变化趋势不明显，都在2.95～3.59 d范围之内波动。在pH6.0时，平均发芽时间最短为2.95 d，说明种子在pH6.0时发芽速度快，发芽能力较好。

表1 不同pH处理对白花三叶草种子萌发的影响

2.2 不同NaCl浓度处理对白三叶草种子萌发的影响

2.2.1 不同NaCl处理对白三叶草种子发芽率的影响

由表2可知，不同盐浓度胁迫下，白三叶草种子的萌发情况不同，表现为：随着盐浓度的增高，发芽率逐渐下降，清水处理萌发率为95.33%，100 mmol/L 处理萌发率仅为26.00%，差异极显著。对数据进行多重比较显示100 mmol/L及以上浓度的NaCl处理后的萌发率显著低于50 mmol/L 处理，说明有盐胁迫的环境能明显降低白三叶草种子的发芽率，增加萌发环境的盐浓度能抑制种子的萌发。但在NaCl浓度为50 mmol/L时仍有64.00%的发芽率，表明白三叶草种子在萌发期对较低浓度的盐胁迫具有一定的耐受性。

2.2.2 不同NaCl处理对白三叶草种子发芽势的影响

由表2可知，不同盐浓度条件下白三叶草种子的发芽势不同，发芽势高低顺序为CK＞50 mmol/L＞150 mmol/L＞100 mmol/L，表现为随着盐浓度的上升，发芽势逐渐降低。方差分析显示，各处理组存在显著性差异，且均与对照组间存在极显著性差异，表明盐浓度对白三叶草种子的发芽速度和整齐度产生明显的影响。

2.2.3 不同NaCl处理对白三叶草种子发芽指数的影响

不同盐浓度条件下，白三叶草种子的发芽指数不同，发芽指数大小顺序为CK＞50 mmol/L＞150 mmol/L＞100 mmol/L。150 mmol/L 与 100 mmol/L处理差异不明显但显著小于50 mmol/L处理，极显著小于对照组，结果表明高盐浓度对白三叶草种子的活力具有显著的抑制作用。

2.2.4 不同NaCl处理对白三叶草种子平均发芽时间的影响

由表2可看出，随着盐浓度的升高，平均发芽时间呈现逐渐延长的趋势，表明盐胁迫延长白三叶草种子萌发的平均发芽时间，导致发芽速度变慢。

表2 不同NaCl浓度处理对白三叶草种子萌发的影响

2.3 不同PEG浓度处理对白三叶草种子萌发的影响

2.3.1 不同PEG浓度处理对白三叶草种子发芽率的影响

由表3可知，不同干旱胁迫条件下白三叶草种子的发芽率不同，表现为随着干旱程度的增加，种子的发芽率逐渐下降，在PEG=5%时发芽率为72.67%，当PEG浓度提高到10%和15%时，种子发芽率显著下降，分别为44.67%和34.67%。进行方差分析得到各PEG处理与对照组间存在极显著性差异。表明PEG处理对白三叶草种子的发芽率具有明显的影响。

2.3.2 不同PEG浓度处理对白三叶草种子发芽势的影响

表3显示，不同干旱胁迫条件下白三叶草种子的发芽势不同，平均发芽势顺序为CK＞5%＞10%＞15%＞20%＞25%，表现为随着干旱程度的增加，种子的发芽势逐渐下降。进行方差分析和多重比较，PEG浓度10%与15%、15%与20%、20%与25%没有明显差异。PEG各浓度处理与对照组之间均存在极显著性差异，表明PEG浓度对种子的发芽速度和整齐度产生了影响。

2.3.3 不同PEG浓度处理对白三叶草种子发芽指数的影响

不同干旱胁迫条件下白三叶草种子的发芽指数不同，发芽指数顺序为CK＞5%＞10%＞15%＞20%＞25%，表现为随着干旱程度的增加，种子的发芽指数逐渐下降。对数据进行方差分析可知，PEG浓度为15%、20%、25%与对照组间均存在极显著性差异，表明高浓度的PEG对白三叶草种子的活力具有明显的影响。

2.3.4 不同PEG浓度处理对白三叶草种子平均发芽时间的影响

由表3可知，在PEG浓度为10%时，平均发芽时间最短（3.76 d），当PEG浓度在10%～25%时，随着PEG浓度升高，平均发芽时间呈现逐渐延长的趋势。说明当PEG浓度大于10%以后，延长了种子的发芽时间，导致萌发能力下降。

表3 不同PEG浓度处理对白三叶草种子萌发的影响

3 结论与讨论

3.1 结论

3.1.1 不同pH处理对白三叶草种子萌发的影响

在不同pH值处理下，白三叶草种子的发芽率、发芽势、发芽指数在pH值为6.0时发芽率（92.67%）、发芽势（36.00%）、发芽指数（21.52）均达到最高，表明白三叶草种子萌发的最佳pH值为6.0，此pH值条件下种子表现出最强的生活力、萌发起始早、发芽整齐，完成整个发芽过程所需时间最短。但是方差分析发现白三叶草种子在pH值为6.0～8.0条件下均能正常萌发，表明白三叶草种子可适应各种土壤类型。

3.1.2 不同浓度盐胁迫对白三叶草种子萌发的影响

在不同NaCl浓度处理下，白三叶草种子的发芽率、发芽势、发芽指数均与对照组间存在极显著性差异。当盐浓度为50 mmol/L时，白三叶草种子仍能保持60%以上的发芽率，说明白三叶草种子能耐受相当于50 mmol/L NaCl浓度的盐胁迫，是一种较为耐盐的植物。盐浓度＞50 mmol/L时，白三叶草种子的萌发受到严重的影响，盐分不仅延迟了种子萌发的起始时间，同时也延长了完成萌发所需的总时长。

3.1.3 不同程度干旱胁迫对白三叶草种子萌发的影响

在不同干旱胁迫条件下，白三叶草种子的发芽率、发芽势、发芽指数、平均发芽时间均呈现出随着PEG浓度的增加而逐渐下降的趋势，且与对照组存在显著性差异，在PEG浓度为5%时，仍有60%以上的发芽率，表明白三叶草种子在发芽期对低程度的干旱具有一定的耐受性。

3.2 讨论

发芽率说明种子的活性，主要是指胚的活性，发芽率高说明具有活性的种子数量多；发芽势说明种子的发芽速度和发芽整齐度；发芽势高，说明种子的整体活力强；发芽势也是反映种子活力强弱的指标，发芽率相同时，发芽势高，种子活力强；平均发芽时间反映种子活力强弱，平均发芽时间短，说明种子活力越强。

土壤环境的酸碱度、电导率和干旱程度是影响种子萌发的重要因素，也是种子萌发过程中最常遇到的逆境因子，因此在研究种子逆境适应性和对逆境的响应时，大部分学者都采用pH值、NaCl溶液模拟盐胁迫和PEG模拟干旱胁迫来进行试验。用培养皿滤纸法、水培法等方法是常用的研究不同pH溶液对种子萌发影响在方法，许多用此方法研究的结果都表明种子在微酸性条件下萌发较好，胚的活性高、发芽速度和发芽整齐度高，种子表现出较强的活力，而且萌发后的幼苗长势好[8-10]。本实验也得到了相似的结论，可能是南方物种长期适应弱酸性土壤的结果。

盐胁迫抑制植物的生长发育，造成植物生理代谢紊乱，不同的生育期有不同的表现形式。盐胁迫影响植物细胞的正常生长代谢过程，导致种子发芽率、发芽势和发芽指数降低[11]。在植物生长的整个生育期中，种子萌发期和幼苗生长期是最重要的2个阶段，其中种子萌发期是最敏感的时期，也是对盐胁迫响应比较敏感的阶段，决定着作物的生长以及产量。不同的研究者用海水、NaCl 溶液和其它盐类模拟盐胁迫条件下不同三叶草品种的种子萌发特性和幼苗的生长特性，几乎都得到了相似的结果，认为盐胁迫对三叶草种子萌发和幼苗生长有一定的抑制作用，且抑制程度随着浓度的提高而增加[12-14]，与本研究结果一致。

水分是种子萌发需要的重要外部条件，是制约种子萌发特性的重要因素。黄文娟等[15]对红果小檗种子的萌发特性进行研究，结果表明，PEG浓度达到10%时，仍有60%以上的萌发率，说明红果小檗种子是一种较为耐旱的植物。本研究得到白花三叶草在PEG浓度为5%时，有60%以上的发芽率，说明白三叶草种子也有一定的耐旱性，但比红果小檗的耐旱性低。