不同地区海芋与混淆品尖尾芋的生药鉴定与显微定量分析研究

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

海芋为天南星科海芋属植物海芋（Alocasia macrorrhiza(L.)Schott）的干燥根茎，又名野芋、狼毒、独角莲、野芋头、坡扣等，载于《本草纲目》，主要分布于我国华南、西南及福建、台湾等地[1]。海芋味辛，性寒，有毒，具有清热解毒、行气止痛、散结消肿等功效，可用于治疗高热流感、风湿关节炎、疔疮肿毒等疾病，同时也是浙江、上海地区地方抗癌用药蛇六谷的来源之一[2-3]。现代研究表明，海芋具有抗肿瘤[4]、抗肝癌[5]、抗炎镇痛[6-7]、抗真菌[8-9]、抗氧化[10]等生物活性。本课题组前期研究发现，海芋石油醚部位对肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤具有明显的抑制作用[11]。

目前国内外对海芋的研究主要集中于化学成分与药理研究，其药材鉴定学资料相对较少，仅有韦松基等[12]和郭微等[13-14]学者的报道，亦未见针对海芋药材的显微定量研究。而且不同地区的海芋由于生长环境的不同，可能在性状、显微及理化方面存在差异。由于海芋属植物种类多样，与海芋亲缘关系相近的植物还有尖尾芋（Alocasia cucullata(Lour.)Schott）、箭叶海芋（Alocasia longiloba(Lour.)Schott）和南海芋（Alocasia hainanica(Lour.)Schott）等[15]。海芋属植物外形相似，极易造成药材品种混淆，误采误食还易造成中毒事件的发生，如神经系统毒性作用[16-18]。尤其同为天南星科海芋属的尖尾芋，在性状、显微及理化特征及药理活性方面与海芋存在诸多相似的特点,如尖尾芋也有抗肿瘤[19]、抗胃癌[20]、抗恶性黑色素瘤[21]等作用。因海芋与尖尾芋均有毒，为保证临床用药的安全性与来源可溯性，有必要对不同地区的海芋和混淆品尖尾芋进行对比分析。本文采用传统的鉴别方法结合显微定量分析法对不同地区的海芋和混淆品尖尾芋药材进行研究，旨在为该药的临床应用及质量控制提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 实验用海芋原植物分别采自重庆、广东、广西、四川、江苏，混淆品尖尾芋采自贵州。样品批号分别为重庆海芋（20150630）、广东海芋（20190308）、广西海芋（20190310）、四川海芋（20190318）、江苏海芋（20190309）、尖尾芋（20190320）。所采植物均为野生，经浙江中医药大学中药资源研究所黄真教授鉴定，海芋为天南星科（Araceae）海芋属（Alocasia）植物海芋（Alocasia macrorrhiza(L.)Schott）的叶及根茎，尖尾芋为天南星科（Araceae）海芋属（Alocasia）植物尖尾芋Alocasia cucullata(Lour.)Schott的叶及根茎。甲醛-醋酸-乙醇（formalin-acetic acid-alcohol，FAA）固定液由10%甲醛5mL，冰醋酸5mL，70%乙醇90mL配制而成。

1.2 仪器 KD-BM生物组织包埋机及KD-BL包埋机冷冻台（浙江金华市科迪仪器设备有限公司），HM430滑动切片机（赛默飞世尔科技有限公司），BX51正置显微镜及DP72显微镜摄影仪（奥林巴斯有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基原鉴定 观察植物形态，结合文献，仔细鉴定不同地区的海芋和尖尾芋根、茎、叶、花、果实等器官，并描述其特征。

1.3.2 性状鉴定 通过眼观、手摸、鼻闻、口尝等方法，对不同地区的海芋和尖尾芋饮片的形状、大小、颜色、表面特征、质地、折断面特征及气、味等进行鉴定。

1.3.3 显微鉴定

1.3.3.1 石蜡永久切片 对海芋和尖尾芋叶片、根茎进行石蜡永久切片制作[22]，显微镜下观察，结合数码显微成像系统记录观察结果。

1.3.3.2 药材粉末制片 取干燥药材粉碎，过60目筛，混合均匀。取少量药材粉末滴加水合氯醛溶液透化，后滴加少许稀甘油，盖上盖玻片后用吸水纸吸去多余液体，显微镜下观察。

1.3.3.3 显微定量分析 显微观测样品制片：将样品粉碎，过100目筛。准确称取25mg样品，加1mL水合氯醛溶液，充分混匀，取混悬液150μL透化，再滴加100μL甘油，用22mm×22mm盖玻片封片。每份样品平行制作3张装片[23-24]。

1.3.3.4 显微特征常数测定 将每张样品制片平分为9个区域，置于10×10倍镜下观察，分别统计9个观测视野中的草酸钙针晶数，合并数据，计算草酸钙针晶数量，并使用显微成像系统测量每张装片中草酸钙针晶的长度。

其中：m为每片中草酸钙针晶的数量（个），v为混悬液总体积（1mL），V 为装片中混悬液体积（150μL），W 为取样量（25mg）。

1.3.4 理化鉴定 取海芋药材粗粉10g，置于圆底烧瓶中，加入75%乙醇100mL，水浴加热回流1h，放冷后过滤。将醇提液分为若干份，分别检查以下项目，观察颜色反应并记录实验结果。见表1。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料若符合正态分布且满足方差齐性，以±s表示，各组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用显著差异法（LSD-t）；不满足方差齐性的计量资料，组间比较采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 理化鉴定检查项目Tab.1 Examination items of physical and chemical identification

2 结果

2.1 基原鉴定 海芋为多年生大型草本植物，高0.5～1.5m，具匍匐、直立地上茎，茎呈圆柱形，直径10～30cm。叶柄长60～90cm，基部扩大成鞘，抱茎；叶片呈阔卵形，先端短尖，亚革质，黄绿色，长50～90cm，宽 40～90cm，边缘波状；侧脉 9～12对，下部较粗，向上渐狭。花序柄呈圆柱形，长12～60cm，2～3枚丛生。佛焰苞管部常卵形或短椭圆形；檐部舟状，先端喙状，长10～30cm。肉穗花序长10～17cm，短于佛焰苞，花序下部为雌花，中部为中性花，上部为雄花；附属器圆锥状，长3～5.5cm，粗1～2cm，嵌以不规则槽纹。浆果红色，卵状，长 8～10mm，粗 5～8mm，种子 1～2 枚。

尖尾芋为直立草本。高15～60cm，地上茎直径 3～6cm，周围具环形叶痕，叶柄基部扩大成鞘。叶片宽卵状心形，先端骤狭具凸尖，膜质至亚革质，深绿色，长10～40cm，宽 7～28cm，边缘全缘；侧脉 5～8 对，叶片下部2对侧脉由中侧基部出发，往下弯曲再往上弧度延伸。花序柄呈圆柱状，长20～30cm，常单生。佛焰苞近肉质，管部长圆状卵形；檐部狭舟状，边缘内卷，先端具狭长的凸尖，长5～10cm，肉穗花序短于佛焰苞，长约10cm，花序下部为雌花，中部为中性花，上部为雄花；附属器狭圆锥形，长约3.5cm，下部粗6mm。浆果近球形，直径6～8mm，种子1枚。

2.2 性状鉴定 不同地区的海芋根茎呈椭圆形、长椭圆形或圆柱形，大小不等，长者可达40cm，直径2～8cm。表面棕色或棕褐色，具明显环状节与圆形根痕。质坚实，断面白色粉质，内皮层环清晰，维管束呈淡黄色点状散在。气微，味淡，嚼之麻舌。商品呈类圆形或长椭圆形片状，厚2～3mm，常卷曲成各种形态，边缘皱缩。见图1A。

尖尾芋根茎呈类圆柱形，大小不等，长10～20cm，直径2.5～4.5cm。表面棕色或棕褐色，具环状节或圆形根痕。质坚硬，断面灰白色粉质样，内皮层环较为明显，维管束呈淡黄色点状散在。气微，味淡，嚼之麻舌。商品呈类圆形片状，厚约3mm，木栓层常向内皱缩，饮片微有卷曲。见图1B。

2.3 显微鉴定

2.3.1 不同地区海芋和混淆品尖尾芋叶片显微鉴定

2.3.1.1 叶片横切面 海芋叶为两面叶。上表皮细胞类长方形、稍大，下表皮细胞类长方形或类圆形，稍小；上下表皮均外被睫毛状角质层，且上表皮角质层较密集，下表皮角质层较稀疏；栅栏组织1～2列，呈短柱状，长45～65μm，约占叶肉组织1/2，上栅栏组织通过主脉，下栅栏组织于中脉处中断；海绵组织位于栅栏组织下方，薄壁细胞形状不规则，排列疏松；主脉呈半圆形，向下显著突起，上面微微突起；维管束外韧型，木质部可见1～2个成对大型导管，以单个大型导管存在居多；主脉薄壁细胞与叶肉细胞中可见草酸钙簇晶和针晶，多分布于靠近气腔边缘及内侧处。不同地区的海芋叶片横切面具有相似的结构特征。见图 2A、图 2B、图 2F。

图1 海芋和尖尾芋药材饮片Fig.1 Medicinal pieces of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott and Alocasia cucullata(Lour.)Schott

尖尾芋为两面叶。上表皮细胞类方形、略大，下表皮细胞较圆、略方，且形状微小于上表皮细胞；上下表皮均具较薄的角质层，上表皮角质层较平坦，下表皮角质层较粗糙，凸起较多；栅栏组织1～2列，呈短柱状，长50～100μm，约占叶肉组织1/3,上栅栏组织通过主脉，下栅栏组织于中脉处中断；海绵组织位于栅栏组织下方，薄壁细胞排列宽广，细胞之间较为疏松；主脉呈半圆形，向下显著突起，上面微微隆起；维管束外韧型，散生，木质部可见1～2个大型导管，以成对导管存在居多；主脉薄壁细胞与叶肉细胞中可见草酸钙簇晶和针晶，分布于气腔周围。见图2C、图2D。

2.3.1.2 叶下表皮撕片 不同地区的海芋下表皮细胞垂周壁较弯曲，排列紧密，气孔较多；气孔平轴式；副卫细胞 2个，长 30～42μm，宽 12～32μm。尖尾芋下表皮细胞垂周壁较弯曲，气孔较多，平轴式；副卫细胞 2个，长 26～35μm，宽 5～10μm。从显微结果观察，可见海芋与尖尾芋的气孔存在细微差别，表现为海芋的气孔副卫细胞宽度较大，而尖尾芋的副卫细胞宽度较窄。见图2E、图3。

2.3.1.3 叶片粉末 不同地区海芋粉末大多墨绿色，存在大量螺纹导管；草酸钙簇晶多见，多集中分布于薄壁细胞中，直径13～30μm；草酸钙针晶成束或散在，长 30～68μm。

尖尾芋粉末墨绿偏深，存在较多螺纹导管；草酸钙簇晶散在分布于薄壁细胞，直径15～27μm；草酸钙针晶散在，长 25～62μm。

2.3.2 不同地区海芋和混淆品尖尾芋根茎显微鉴定

2.3.2.1 根茎横切面 海芋表皮细胞1列，切向延长，常脱落。木栓层较厚，由7～12列细胞组成，类长方形，切向长 34～104μm，径向长 17～35μm，排列不甚规则。皮层细胞类圆形，排列疏松，散有外韧型根迹维管束，近木栓层处的细胞受挤压呈类长方形。中柱维管束散在，多周木型，少外韧型，存在维管束走向不规则者；导管多数。薄壁组织中散有黏液细胞，内含草酸钙针晶及簇晶；薄壁细胞中含淀粉粒。不同地区海芋结构相似，其中广东、广西、江苏产海芋根茎中草酸钙针晶与簇晶极为明显，四川产海芋根茎中可见较多棕色块，多分布于导管附近薄壁组织。见图4。

尖尾芋表皮细胞一列，切向延长，常脱落。木栓层较厚，由5～6列扁平类长方形细胞组成。排列不甚规则。皮层细胞类圆形，排列较为疏松，散在外韧型根迹维管束。中柱维管束较多周木型，亦有外韧型维管束散在；导管多数，薄壁细胞中含黏液细胞，内含草酸钙簇晶与草酸钙针晶。数量相对于海芋根茎较少。见图4F。

2.3.2.2 根茎粉末 海芋粉末黄白色。淀粉粒较多，常为单粒，呈长卵形、肾形或类圆形，直径3～17μm，脐点及层纹均不明显。草酸钙针晶单个散在或成束存在于黏液细胞中，长29～90μm。草酸钙簇晶较多，直径26～65μm，棱角较尖锐。导管为环纹导管和螺纹导管，直径24～95μm。木栓细胞黄棕色，类方形。棕色块黄棕色或红棕色，类圆形或椭圆形，散在。见图5。尖尾芋粉末黄白色。淀粉粒众多，常以单粒存在，类圆形居多，直径4～25μm，脐点及层纹均不明显。草酸钙针晶较少，单个散在或成束分布，长30～88μm。草酸钙簇晶直径21～55μm，棱角较尖锐。环纹导管居多，直径20～80μm。木栓细胞黄棕色，类方形或长方形。棕色块黄棕至深红棕色，较不规则，散在。

图2 海芋与尖尾芋叶显微鉴定Fig.2 Microscopic images of the leaves of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott and Alocasia cucullata(Lour.)Schott

2.3.3 显微定量分析 根据实验结果，重庆海芋草酸钙针晶数量为86.28～125.11个/mg，广东海芋128.27～140.53 个/mg，广西海芋为 116.80～137.07 个/mg，四川海芋为104.27～122.40个/mg，江苏海芋为114.93～137.07 个/mg,贵州海芋为 76.00～101.33 个/mg，6 组数据均满足方差齐性，且与尖尾芋相比，广东、广西、四川、江苏四个地区的海芋根茎中草酸钙针晶数均有统计学意义（P＜0.05）。重庆海芋草酸钙针晶平均长度为 44.72～46.40μm，广东海芋为 63.05～66.77μm，广西海芋为 57.62～62.27μm，四川海芋为 48.47～51.04μm，江苏海芋为58.75～62.88μm，尖尾芋草酸钙针晶平均长度为56.89～64.19μm，6组数据均满足方差齐性，且重庆，广东与四川海芋针晶长度与尖尾芋相比有显著性差异（P＜0.05）。见表 2。

图3 不同地区的海芋与混淆品尖尾芋叶下表皮撕片气孔(400×)Fig.3 Stomata of tear surface of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott lower epidermis in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott lower epidermis(400×)

表2 不同地区的海芋与混淆品尖尾芋根茎草酸钙针晶的显微数量统计（±s，n=3）Tab.2 The microscopic quantitative statistics of needle-like calcium oxalate crystal in the rhizome of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott(±s,n=3)

表2 不同地区的海芋与混淆品尖尾芋根茎草酸钙针晶的显微数量统计（±s，n=3）Tab.2 The microscopic quantitative statistics of needle-like calcium oxalate crystal in the rhizome of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott(±s,n=3)

注：不同地区的海芋与尖尾芋针晶数量与长度比较，*P＜0.05Note:The comparisom of the number and length of needle crystals between Alocassia macrorrhiza(L)Scott and Alocassia cullata(Lour.)Scott in different regions,*P＜0.05

样品 草酸钙针晶数量（个/mg） 草酸钙针晶长度（μm）重庆海芋广东海芋广西海芋四川海芋江苏海芋尖尾芋107.31±19.61 134.22±6.14*125.33±10.50*112.44±9.20*126.67±11.13*87.11±12.95 45.73±0.88*65.31±1.99*60.68±2.65 50.02±1.36*60.31±2.24 60.61±3.65

2.4 理化鉴定 不同地区海芋根茎醇提液含鞣质（加三氯化铁显墨绿色，加氯化钠明胶产生白色沉淀），其中江苏产海芋醇提液三氯化铁颜色反应最为明显；尖尾芋根茎醇提液含较少鞣质（加三氯化铁显浅绿色，加氯化钠明胶产生白色浑浊）。不同地区海芋均含有皂苷（泡沫实验泡沫不消失）；尖尾芋不含或含少量皂苷（泡沫实验为负性结果）。不同地区海芋和尖尾芋均含有机酸（pH 5～6）。不同地区海芋均含黄酮（加盐酸-镁粉显橙红色；氨熏试验呈黄色，紫外下显黄色荧光；荧光试验有强烈荧光），其中江苏与广东结果较为明显；尖尾芋不含或含较少黄酮（盐酸-镁粉反应，氨熏试验，紫外观察及荧光试验均为负性结果）。不同地区海芋均含甾醇、三萜类（Salkowski氯仿-浓硫酸反应，硫酸层呈现红色或蓝色，氯仿层有绿色荧光出现）；尖尾芋含甾醇、三萜类（Salkowski氯仿-浓硫酸反应，硫酸层呈现蓝色，氯仿层无绿色荧光出现）。不同地区海芋和尖尾芋均含生物碱（加碘化铋钾产生橘红色无定形沉淀；加硅钨酸产生淡黄色沉淀）。初步证明海芋根茎中含有鞣质、皂苷、有机酸、黄酮、甾醇、三萜类、生物碱等化学成分，而尖尾芋中鞣质、皂苷及黄酮含量较少或无。

图4 不同地区的海芋和混淆品尖尾芋根茎显微鉴定（40×）Fig.4 Microscopic images of the rhizome of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott（40×）

3 讨论

3.1 不同地区海芋对比分析 实验结果显示，不同地区的海芋原植物特征，叶片和根茎的性状特征及显微特征均十分相似。具环状节与圆形根痕，断面具内皮层环与点状维管束，嚼之麻舌；显微镜下可见根茎中柱维管束多周木型，少外韧型，黏液细胞中含草酸钙针晶和簇晶；理化鉴定可初步证明海芋根茎中含有鞣质、皂苷、有机酸、黄酮、甾醇、三萜类和生物碱等化学成分。由于不同地区海芋的生长环境不同，海芋之间的细胞内含物可能略有差异。表现为根茎横切面中，广东、广西及江苏海芋的草酸钙针晶及簇晶数量较多，且广东海芋针晶的平均长度较长，四川海芋根茎的导管周围棕色块较多；在理化检验中江苏的鞣质反应较明显，广东与江苏的黄酮颜色反应较明显，其他方面几无差异。以上实验表明不同地区海芋的性状特征基本一致，可作为海芋的鉴别特征。

图5 海芋根茎粉末显微鉴定(400×)Fig.5 Microscopic images of the rhizome powder of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott(400×)

3.2 海芋与尖尾芋的对比分析

3.2.1 海芋与尖尾芋的基原鉴别 笔者对不同地区的海芋与混淆品尖尾芋的鉴别研究发现，作为海芋的亲近缘种，尖尾芋与海芋存在较大的相似之处。首先二者均为直立草本，具环形叶痕，叶柄基部扩大成鞘，花序柄圆柱形，檐部舟状，具佛焰苞，肉穗花絮。花序下部为雌花，中部为中性花，上部为雄花，果实类型为浆果等。但海芋个体较大，叶片先端短尖，边缘波状，侧脉数较多，花序柄2～3枚丛生，种子1～2枚；尖尾芋个体较小，叶片尖端骤狭具凸尖，边缘全缘，侧脉数较少，花序柄常单生，种子1枚等。

3.2.2 海芋与尖尾芋叶的鉴别 海芋与尖尾芋的叶片均为两面叶，上表皮细胞较大于下表皮细胞；均有上下两层栅栏组织，且上栅栏组织通过主脉，维管束外韧型具1～2个导管；薄壁细胞中均含草酸钙针晶与簇晶。海芋上表皮具睫毛状角质层，栅栏组织约占叶肉组织1/2，以单个大型导管为主；尖尾芋上表皮角质层较平坦，栅栏组织约占叶肉组织1/3，以成对导管为主。且叶片显微中观察到在下表皮细胞中，尖尾芋的气孔副卫细胞宽度较窄，而海芋副卫细胞较宽。

3.2.3 海芋与尖尾芋根茎的鉴别 在药材饮片的观察中，不同地区的海芋与尖尾芋均呈圆柱形，表面棕色或棕褐色，具明显的环状节与圆形根痕。质坚实，断面粉质，内皮层环明显，维管束淡黄色点状散在。海芋卷曲程度较大，边缘皱缩，尖尾芋卷曲程度较小，形状较为规则。根茎显微中海芋和尖尾芋的结构特征相似，均由木栓层、皮层、根迹维管束、中柱维管束等组成，且薄壁细胞中均含草酸钙针晶及簇晶。但海芋木栓层较厚，尖尾芋木栓层较薄。从实验结果中观察到海芋根茎的草酸钙针晶和簇晶数量也明显多于尖尾芋。理化实验发现海芋和尖尾芋均含鞣质、有机酸、甾醇、三萜类、生物碱等化合物，但尖尾芋颜色反应不及海芋明显。提示可能尖尾芋根茎中上述含量较少，且尖尾芋中皂苷及黄酮含量不易检出。

目前关于海芋属植物的鉴别分析资料较少，海芋与尖尾芋的鉴别特征也只有郭微与张宏伟等人[13-14]关于海芋与尖尾芋地上部分尤其是叶的比较分析，未有对海芋与尖尾芋根茎进行鉴定研究。本文运用传统的中药鉴定方法与显微定量分析法对不同地区的海芋及尖尾芋进行研究，所得海芋的特征描述具有代表性，结果不但完善了海芋药材的鉴定学资料，还为海芋属近缘植物的鉴别提供参考。尤其在药材区分中，根茎横切面草酸钙结晶的类型与分布可作为海芋的主要显微鉴别特征。