天然产物——作物保护化合物开发中的一种战略性先导化合物发现途径

筱 禾 编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

天然产物(NPs)作为活性成分的来源和大量医药和作物保护化合物的开发源泉由来已久。在过去的大约35年中，在某种程度上NPs占美国食品药品监督管理局(FDA)全部新批准药物的30%～35%。同样地，60多年来NPs在作物保护新活性成分开发中具有极为重要的作用。近期销售数据(2016)表明，NPs对不同类型的作物保护化合物(杀虫剂、杀菌剂和除草剂)开发的影响不同：对杀虫剂的影响最大，对杀菌剂的影响次之，对除草剂的影响相当有限(图1)。但NPs对作物保护化合物的重要性在于其占已知作用机制(MoAs)的60%以上。以杀虫剂为例，基于NPs/NP衍生或NP合成等效体(NPSE)(图1)产品的销售额占全球销售额的70%以上。因此，NPs影响作物保护化合物开发的潜力依然很大。

尽管NPs的以往作用和未来潜力影响作物保护化合物的开发，但 NP源的发现仍然面临挑战。20世纪80年代末至90年代初，医药行业中NP的发现有所下降，同期组合库和高通量筛选兴起。当时，NP库被认为与高通量筛选不太兼容。再加之对耗费大量时间和精力却收益较少的 NP开发过程日益不满。医药行业偏离 NP发现的另一个影响因素是引入并通过了于1993年12月29日生效的生物多样性条约，或称生物多样性公约(CBD)。但对“生物多样性公约”的遵守较为复杂，并可能成为各国从其自然资源中获益的障碍。基于 NP的发现可能存在低收益的风险；很少发现真正具有产品潜力的分子。另外，将一种新的作物保护产品商品化的成本越来越高，使得基于 NP的发现非常具有挑战性。只有当分子在模型或田间条件下表现出强大的活性时，才会对作物保护化学物质或NPs进行投资，并且在涉及生物资源的前期费用或长期负债较高的情况下，可能会进一步限制对NPs的兴趣和评估。最理想的情况是，各国降低生物资源的准入成本，对稀有成果的利益分享做出明确的法律定义。

寻找新NPs的挑战过去是并且仍然是一个重大问题。正如最近对过去45年中发现的NP进行的分析所观察到的那样，每年都会发现更多的NP，但发现真正新颖的NP是成比例减少的。Pye等人的潜在影响研究发现：⑴ 许多NP已被鉴定，但尚未深入探索生物效用或新机遇，以及⑵ 如果要发现新颖NP，则需要不同的NP发现来源和方法。

图1 天然产物(NPs)、半合成产品、NP仿生产品或具有NP模型但通过其他手段[NP合成等效体(NPSE)]发现的化学领域对2016年终端用户销售的影响

与医药行业不同，作物保护公司对NPs的兴趣并没有以同样的方式下降。对NPs作为新作物保护化合物来源的兴趣的一个衡量标准是，参与新除草剂、杀菌剂和杀虫剂开发的作物保护公司每年平均发表的有关NPs的出版物数量。与医药行业形成对比的是，作物保护(农化)行业对 NPs的兴趣已有一段时间了，特别是从20世纪90年代开始(图2)，就像医药行业的兴趣正在下降一样。但图2中的数据也可能是对行业兴趣和研究工作的低估，因为行业中对出版的重视程度低于学术。20世纪 90年代初在 20个作物保护公司中进行的一项调查的结果也证实了业界对NPs的兴趣，其详细说明了对NPs作为新农用化学品起始点的来源的浓厚兴趣。

图2 参与新农用化学品开发的作物保护公司每年关于天然产物(NPs)的平均文章数

作物保护研究机构利用了许多开发方法，NP源的开发只是其中之一。此外，有关开发一种新的作物保护产品的严重挑战包括将一种分子商品化所需的时间持续增加，平均为10～12年，以及发现和开发一种新的农药产品的成本最终估计为 2.86亿美元。因此，农化公司寻求增加成功概率和加快产品构建的方法至关重要(图 3)。科迪华农业科技公司(CAS)采用的一种策略是开发利用NPs。如上所述，相当比例的作物保护化合物的已知 MoA的确定与NPs有关或可能有关。因此，NP源开发项目仍有可能发现具有新颖MoA的新作物保护化合物，这是作物保护产品开发的重要途径之一。尽管作物保护行业对NPs的兴趣由来已久，但NP源的开发仍然是为新的作物保护化合物提供灵感和产品的一个具有挑战性的来源。虽然1993年参与调研的大部分(65%)公司在利用 NPs作为开发手段方面取得了一些成功，但这些公司中的大多数已经放弃了独自进行NP开发，更多的是采用对外协作。如今，很少有公司独立开展有关NPs分离和鉴定的项目。偏离NP源开发的原因有如下几点。首先，如上所述，是寻找真正的新的NPs的根本挑战和难题。其次，很少有NPs作为作物保护产品直接应用时具有稳定的理化性质，可能需要一定程度的半合成以解决转化和/或稳定性限制以及提高药效。最常见的是，NPs最适合作为合成模拟的灵感。但是，将复杂的 NP变成可合成的化学物质可能比其他先导化合物产生方法所耗时间更久。

在CAS(前陶氏益农公司)公司内，NP源的开发是有着悠久历史的先导化合物产生方法，始于礼来(Elanco)公司的NP研究，后转入1989年创办的陶氏化学与 Elanco作物保护合资企业(DowElanco)进行。在20世纪40年代，礼来公司是生产抗生素——青霉素的主要公司之一，随后在50年代和60年代开发并成功上市了微生物源抗生素——红霉素(erythromycin)、万古霉素(vancomycin)、头孢霉素(cephalosporin)和泰乐霉素(tylosin)。DowElanco/DAS/科迪华农业科技公司对NP源先导化合物产生的兴趣持续高涨，部分是由于成功发现并开发了多杀菌素(spinosad)，该化合物是一种土壤微生物产生的NPs，其是自然产生的具高杀虫活性大环内酯spinosyns A、D混合物。对NP源杀虫剂的持续关注激励了第2个基于spinosyns的半合成杀虫剂乙基多杀菌素(spinetoram)的开发。在此过程中，发现的一类新的spinosyns(21-丁烯基)和利用spinosyn生物合成途径生成新的spinosyn衍生物也有助于保持研究NPs的兴趣。最近，科迪华公司NP源开发项目继续推出新的作物保护化合物，包括新杀菌剂fenpicoxamid和 florylpicoxamid 以及新的具杀虫活性合成spinosyn类似物。如上所述，NP源开发项目的重要优势之一是提高了发现具有新颖MoAs的作物保护化合物的可能性。这一结果在spinosyns和新的杀菌化合物中得到了验证，并进一步促进了CAS对 NP源先导化合物发现的兴趣。下文将讨论科迪华公司 NP开发的途径，包括对菌株保藏的概述，并对科迪华公司经典 NP开发项目进行重点介绍，最后展望未来，用新途径加快NP开发的选择。

1 先导化合物发现方法

如上所述，作物保护产品开发中的先导化合物发现方式多种多样。在CAS，这些被划分为3个大的方面：竞争者启发(competitor inspired activities)、生物活性假说(bioactive hypotheses)以及NP发现(图3)。竞争启发先导化合物发现方法某种程度上明显是致力于从专利和科学文献中拾遗，是一种被广泛采用和推出商业化产品的成功途径。话虽如此，此途径在CAS的实施情况略有不同，因为其目的是确定开发和推出新颖农药活性基序(motifs)和骨架的起始点，而不是找到知识产权方面的漏洞并获得衍生类似物的权利。先导化合物发现的第2种途径是生物活性假说，生物活性先导化合物到生物农药活性的概念是此途径的核心。研究人员确定了在任一体系、细胞或整个有机体中表现某种生物反应的特异骨架、基序、官能团以及化合物。这证实了在开发新化合物时引入此类骨架、基序或官能团诱发某种生物反应的可能性更大的观点。这种证据和核心(如骨架)与生物反应间的相关性越强，就越有可能观察到新化合物的生物活性。此外，这一途径取决于早期确保在化合物中构建理想的物理特性，以增加从离体细胞测试到活体植物和昆虫测试的转化。第3种先导化合物发现途径以NPs为中心。NP发现已经且依然是科迪华公司发现先导化合物的三大支柱之一，一定程度上是受NP源产品的影响，如spinosyns(多杀菌素、乙基多杀菌素)带来超过4亿美元的终端销售额(2014-2016年)。在近 30年，DowElanco/陶氏益农/科迪华农业科技公司NP发现项目的根本是新的、新颖的NPs的鉴定和分离。为了最大限度地提高发现新颖活性分子的机会，已对生物多样性投入进行了仔细审查。

图3 利用一系列途径发现先导物

2 天然产物保藏库

传统生物学假设生物多样性分布不均，在热带和海洋环境以及大自然中而非城市和景观中的可观测物种数量丰富。为了对 NP发现的多样性进行取样，在过去30年，科迪华的NP项目约有90%的投资是与50多个私人、学术和政府实体合作的结果。通过第三方采购，可以从广泛的地理、环境和分类学来源对生物多样性进行采样。在过去25年中，第三方来源的科迪华NP发现包括850 000多个NP提取物和2 500多个NPs纯品。其中的绝大多数都是在2013年之前筛选的。从那时起直到现在，科迪华已转向更有针对性的NP投资途径。

科迪华NP发现工作的其余部分(约10%)致力于对科迪华菌种保藏库中的微生物(细菌、放线菌和真菌)进行评价(图4)。该菌种保藏库约有44 000个菌株，主要是由科迪华、礼来和Mycogen公司的科研人员历经30多年从美国土样中分离所得。从第三方购买了大约10 000个菌种。有三分之一的生物体是因关注新抗虫性状的发现而获得的，其余的是为了发现 NP所得。该保藏库在很大程度上没有分类学特征，因为它是在假设来源的多样性导致生物活性的多样性的前提下以高通量方式组合的。最近使用16S测序表征该保藏库的研究揭示了广泛的分类学多样性，如图4所示。该保藏库的生物体分为3类：14 400个细菌(性状为主)、10 000个真菌(NP为主)和19 800个放线菌(NP为主)。细菌保藏库包括6 800个苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株和7 600个非Bt细菌菌株(图 4)。大部分非 Bt细菌菌株属于非丝状放线菌属，如微球菌(Micrococcus)和短小杆菌(Curtobacteria)。这10 000个真菌菌株中尽管有相当数量的植物病原真菌和昆虫病原真菌，但主要是未鉴定的土壤真菌。19 800个放线菌菌株大多属于丝状放线菌属，包括约50%的链霉菌和50%的稀有放线菌，如小单孢菌(Micromonospora)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、游动放线菌(Actinoplanes)(图4)。最近，对微生物基因组的研究表明，微生物，特别是放线菌和真菌具有大量在正常实验室条件下不表达的神秘生物合成途径。因此，科迪华菌种保藏库中的菌株对 NP发现的深入研究具有重要的价值。游动放线菌保藏库将是科迪华公司未来几年的热点，将利用代谢基因组学进行进一步研究。

图4 原陶氏益农(现科迪华)菌种保藏

3 天然产物鉴定策略

用于鉴定发酵液或提取物中令人关注的NPs的策略通常有2种：⑴ 以生物活性为基础的策略或⑵以结构为基础的策略(图5)。以生物活性为基础的策略包括对粗提物/发酵液进行生物测试评价，如离体杀菌测试。具有活性的粗提物/发酵液随后被分馏，并进行适当的生物测试再次评价。对确认生物活性的组分进行纯化，利用NMR和MS对任一分离化合物进行结构鉴定。以结构为基础的策略从对粗提物/发酵液中独特的结构/物理性质属性的分析评价开始。根据分析评估，与已有的科迪华 NP保藏库进行对比，以新颖性对粗提混合物进行分馏。对组分的独特结构特征进行重新评估，随后进行提纯，并进行生物活性测试。尽管时间很长，但科迪华对基于生物活性的策略的关注已被证明在鉴定农化相关NPs方面卓有成效。目前使用的具体工作流程和筛选级联(screening cascade)如图6所示。科迪华基于生物活性的NP发现策略发现了50多种化合物被归类为苗头化合物(hits)，7种具更特别特性的化合物，包括更高的生物活性，被归类为活性化合物(actives)。应该注意的是，NP苗头化合物必须满足科迪华自己的效用阈值，这与前面讨论的其他先导化合物生成方法得到的苗头化合物和活性化合物类似。从1 665种提取物中提取的这些分子具有足够用于进一步测试的活性。共有704个提取物被分馏，发现了50多个新颖的苗头化合物。对从供应商或合作者处获得的2 500个纯NPs进行靶标筛选，得到了100多个苗头化合物和4个活性化合物。这些分子因独特的化学或生物活性被先验选择，因此具有较高的初始命中率。

图6 目前科迪华公司用于天然产物(NP)发现的途径

4 实例研究

科迪华在具杀虫活性NPs研究中取得了巨大的成绩，特别是多杀菌素和乙基多杀菌素，最近还开发了spinosyns的简化合成模拟物。这些为NP研究工作提供了平台。因此，从这个角度来看，实例研究将侧重于NP研究工作因与spinosyn相关NP工作的遗留和成功而成为可能。

例如科迪华关于mevalocidin的前期工作利用这种方法成功地发现了一个感兴趣的新NP (图7)。在Mycosynthetix的海量真菌提取物筛选中，科迪华从Coniolariella属的 2个真菌菌株 MSX92917(DA092917)和 MSX56446 (DA056446)的静态培养中发现了mevalocidin。Mevalocidin对禾本科和阔叶杂草具有广谱苗后活性。用mevalocidin处理的植物症状表明其对禾本科杂草和阔叶杂草具有新颖的作用机制和双向移动性(ambi-mobility)。虽然NP以高剂量施用表现出良好的苗后活性，但一项对mevalocidin的研究表明，其构效关系范围甚小，且到目前为止性能并未得到明显增强。Mevalocidin被认为是通过干扰细胞质中甲羟戊酸/异戊二烯生物合成途径的早期步骤而致效(图7)。对拟南芥的一些初步研究表明，活化和代谢(一种原毒素)可能在mevalocidin的总体效果中发挥作用(数据未发表)。此外，生成mevalocidin所需的真菌生物合成机制尚不清楚。为了增强mevalocidin和/或mevalocidin类似物的效果，有必要进行深入研究以了解生物合成、作用机制和在植物体内的归趋。

最近，介绍了目前正在由科迪华开发的、与日本明治制果株式会社合作发现的一种新颖吡啶酰胺类杀菌剂 fenpicoxamid (图 8)的一些生物学特性。Fenpicoxamid是最初从放线菌链霉菌517-02发酵液中分离得到的天然抗菌化合物UK-2A的衍生物，此发酵液的提取物在离体试验中对大多数真菌具有很强的抗菌活性(图6)。吡啶酰胺类化学物质通过与细胞色素 BC1复合物的 Qi位点结合来抑制线粒体呼吸，且与作用于 Qo靶标位点的甲氧基丙烯酸酯类无靶标位点交互抗性。

基于上述原因，UK-2A被认为是值得关注的半合成修饰候选物质，以优化固有的抗菌活性和植物病原体防治所需的其他关键特性。由UK-2A发酵后一步合成的fenpicoxamid对欧洲最受关注的冬小麦病原物Zymoseptor tritici(同Mycosphaerella graminicola，小麦叶斑病)具有优异的防效。凭借其新颖的生化作用机制，fenpicoxamid预计将成为欧盟谷类作物抗性治理项目的重要补充。

UK-2A所具有其他可进行半合成修饰的结构特征，为进行构效关系(SAR)研究提供了机会。合成策略侧重于研究UK-2A的3个区域：替代“头部”基团、C7环外酯和C8苄基取代基(图9)。制备了250多个类似物并评估了它们用于防治小麦叶斑病以及合成的可行性。这些类似物的典型合成路线如图10所示，虽然一些结构替换使类似物的离体药效与fenpicoxamid相当，甚至略好，但其功效增益不值得开发。

图7 萜类生物合成中的甲羟戊酸途径

图8 fenpicoxamide和UK-2A的结构式

5 未来NP发现的可能方向

尽管在NPs方面的工作取得了成功，但由于高水平的重复发现，易获得的骨架缺乏新颖性以及上述由于生物多样性在获取大量样品方面的难度，历史上依靠采样来自不同地理来源的大量 NP提取物不再被认为是一条可行的途径。经过广泛分析，当前的 NP策略已经转变为包括其他途径，例如更有 靶向性来源的NPs。

图9 合成衍生化策略

图10 UK-2A的3个区域的衍生化

全基因组测序、宏基因组学和合成生物学方面的最新进展，加之更灵敏的质谱和核磁共振性能，已经迎来了被称为NP发现的“新黄金时代”或“复兴”。研究人员已经成功地证明，基因组导向(genome-guided)的NP发现通过直接从gDNA中捕获基因簇并随后在异源寄主中表达得到新颖的 NP骨架。但这种方法的潜力尚未充分实现，因为在鉴定新颖生物合成基因簇(BGC)和随后预测化学结构方面存在生物信息学的挑战。一种更可行的方法是基因组分析和代谢组学数据相结合，以更准确地使BGC与已知和未知NP家族的关联。这种方法的成功与产生的数据集的规模以及多样化的菌株保藏直接相关，因为在系统发育和NP BGCs间具有明显的相关性。Metcalf等人的研究表明，相隔0.5%核糖体蛋白距离的2个菌株可能共享几乎所有的NP基因簇，而相隔7%的则几乎没有。这种方法在发现新的NP骨架方面有着广阔的应用前景，这对于能够大量获得这些新颖骨架进行SAR探讨并最终用于大规模生产至关重要。在传统的合成化学方法可能不适用或不经济的情况下，利用合成生物学可以获得 NP类似物和合成的有价值中间体。利用合成生物学大规模制备关键前体的一个非常成功的例子是青蒿素的前体——青蒿酸的生产。将青蒿(Artemisia annua)的基因簇嵌入重组酵母寄主中，得到了25 g/L发酵效价的青蒿酸。

6 天然产物发现缺口

必须加强行业和科研机构之间的联系，取长补短，利用NPs带来的机遇，更好地探讨这些不断发展的技术。许多科研团队已经分离出了新颖的NPs，但他们没有完整评估化合物的作物保护生物活性/效用的技术手段。2018年9月25-29日在意大利Bellagio召开的“害物治理中的天然产品：增加其使用的创新方法”会议中，演讲者、科研机构以及计划增加技术手段和降低壁垒测定这些NPs的潜在行业合作伙伴(例如科迪华)就 NPs和相关的植保测试体系间的这种关系达成了共识。科迪华愿与相关科研机构/团队/公司开展互利共赢合作研究。

7 结 语

NPs具有化学多样性来源、生物功能和新颖的作用机制。作物保护公司和医药公司都在继续并增加对NP研究的投入。尽管基于NP的发现面临挑战，但鉴定新作用机制和新化学起始点的优势使其成为一个值得追求的目标。展望未来，基因组学的出现及其在 NP发现中的应用可以加速鉴定和开发 NPs或受NPs启发的农用化学解决方案。