温度对四川华鳊胚胎发育的影响

王亚利，解崇友，尹 敏，蔡瑞钰，王志坚

( 西南大学 生命科学学院，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室， 水产科学重庆市市级重点实验室，重庆 400715 )

四川华鳊(Sinibramataeniatus)，属鲤形目、鲤科、鲌亚科、华鳊属，俗称墨线鱼，杂食性，仅分布于岷江、大渡河和嘉陵江等水域，是长江上游特有鱼类，有较大社会价值和经济价值[1-2]。近年来受岷江、嘉陵江等流域拦河筑坝、过度捕捞的影响，四川华鳊适宜生境减少，并出现了小型化趋势，资源量不断下降[3-4]。目前有关四川华鳊的研究主要集中在其分类学、生态学、线粒体基因组繁殖生物学[3-7]等工作，暂无胚胎发育相关研究。要对四川华鳊胚胎方面展开研究，其人工繁殖技术必然要取得突破。四川华鳊成熟亲鱼在室内养殖驯养已取得初步成功，其抗病性强，温度耐受范围广，易于养殖，因此其人工繁殖得以攻克。鱼类的胚胎发育是个复杂的过程，受温度、溶解氧、pH、盐度、光照度等[8-11]因素的影响。温度是鱼类胚胎发育的重要影响因子之一，不同鱼类孵化需要不同的温度，适温范围也会不同[12]。确定鱼类胚胎发育的适宜温度范围，是人工繁育所必须掌握的生物学基础。因此，众多学者就温度对不同鱼类的胚胎发育影响进行了大量研究，主要为高海拔鱼类[13-14]，为水产苗种繁育以及资源增殖提供了重要的参考依据。人工增殖放流作为种质资源保护的有效手段[15]，可实现四川华鳊资源量的恢复。通过观察四川华鳊胚胎发育过程，评估不同孵化温度条件对受精率、胚胎发育速率、畸形率和孵化率等生物学指标的影响情况，以期明确四川华鳊孵化的适宜温度范围，并为今后四川华鳊的研究及资源开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 亲鱼来源

四川华鳊于2017年5月在岷江水域采集，此后驯养在实验室4.0 m×0.55 m×0.4 m的循环水池中。

1.2 人工催产及胚胎孵化

2018年7月中旬，挑选性腺发育良好、体质健壮、无病伤的成熟亲鱼，雌鱼体质量为15～25 g，雄鱼体质量为7～13 g，按雌雄3∶1的比例进行人工催产，效应时间结束后采用干法授精获得受精卵。受精卵置于18个直径14.5 cm、高2.8 cm的玻璃培养皿中，分为6个温度组(16、19、22、25、28、31 ℃)，每组设置3个平行，放入相应水温的45 cm×25 cm×25 cm玻璃缸中孵化，水温变化均控制在±0.5 ℃内。每个培养皿中胚胎数量约200个。

1.3 胚胎观察

胚胎发育过程用体视显微镜(尼康SMZ25)进行观察和拍照，记录各发育阶段的形态特征及发育时间，以50%胚胎出现新特征作为划分发育时期的依据。四川华鳊胚胎发育过程主要参照文献[16]的方法进行分期。25 ℃组的胚胎自受精后的整个发育过程采取连续观察，其余5个温度组整个过程则每隔30 min观察一次，每次观察时间均不超过3 min，整个观察过程控制温度变化不超过0.5 ℃及观察行为不影响胚胎的正常发育。

1.4 不同温度胚胎发育

统计不同温度下胚胎从一个时期发育到下一时期所用时间及每个时期胚胎的死亡数量，并及时剔除死卵，以免污染水体和影响胚胎发育，记录各试验组的受精率(原肠胚期后统计受精率)、孵化率、畸形率、孵化历时，计算胚胎发育的生物学零度、有效积温。

受精率%=n1/n2×100%

孵化率%=n3/n1×100%

畸形率%=n4/n3×100%

成活率%=n5/n6×100%

生物学零度：

有效积温：K=t×(T-C)

式中，n1为受精卵数，n2为卵子总数，n3为孵出仔鱼数，n4为畸形仔鱼数，n5成活仔鱼数，n6为出膜仔鱼数，C为胚胎发育的生物学零度(℃)，n为试验设计的温度梯度的个数，T表示胚胎发育的水温(℃)，t表示胚胎完成发育所需要的时间，V为胚胎发育所需时间的倒数(1/t)，K表示胚胎发育的有效积温(℃·h)。

1.5 数据处理

数据的处理与分析在Excel 2013和SPSS 22.0中进行，显著性水平为0.05，描述性统计值用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 胚胎发育过程(25 ℃条件下)

在水温(25±0.5) ℃时，四川华鳊的胚胎发育根据其外部形态特征可分为受精卵、胚盘形成、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官分化和出膜期8个连续发育阶段(图1)，各发育阶段的形态描述见表1，整个胚胎发育历时44.83 h。

2.1.1 受精卵

成熟卵为圆球形、淡黄色，卵径为(1.34±0.01) mm，具黏性(图1a)。受精后，受精卵吸水膨胀，呈透明状，卵径1.50～1.68 mm，卵质分布均匀，极性不明显(图1b)。

2.1.2 胚盘形成阶段

受精0.67 h后，原生质集中于动物极，动物极中央渐渐凸起形成一圆盘状隆起，胚盘形成(图1c)。

2.1.3 卵裂阶段

受精0.82 h后，胚盘中央出现分裂沟，细胞一分为二，此时为2细胞时期(图1d)；随后进行第2～6次卵裂(图1e～i)，细胞呈几何级数增加，随着分裂次数增加，分裂球越来越小，形成多细胞胚体，进入多细胞期(图1j)。

2.1.4 囊胚期

受精2.85 h后，分裂球很小，细胞间隙模糊，各分裂球高高堆叠在卵黄上，形成囊胚，囊胚高为0.31 mm、横径为0.63 mm，此时为囊胚早期(图1k)；受精3.70 h后，囊胚的高度不断下降，囊胚层变薄，与卵黄囊界限模糊，此时为囊胚中期(图1l)；受精5.27 h后，囊胚表面细胞向卵黄部分下包，约占整个胚胎的1/3，此时为囊胚晚期(图1m)。

2.1.5 原肠胚期

受精6.65 h后，胚盘继续下包至1/2，胚层外周形成环状增厚细胞带，形成胚环，此时为原肠胚早期(图1n)；受精7.37 h后，胚环下包至2/3，胚盾出现，此时为原肠胚中期(图1o)；受精后7.77 h，胚盘下包约3/4，胚胎植物极有一大卵黄栓外露，胚盾增厚，背唇明显，此时为原肠胚晚期(图1p)。

2.1.6 神经胚期

受精后8.43 h，胚盘下包约4/5，胚环变小，仅露出植物极端在外形成原口，未包入的卵黄称为卵黄栓，胚胎背面中线的细胞增厚形成神经板，脑部渐膨大，胚胎进入神经胚期(图1q)；受精后9.07 h，随着胚层进一步下包，卵黄变成不规则圆形，外露渐小，最后卵黄栓消失，在卵黄栓末端形成圆形有凹陷的胚孔，受精后10.12 h，胚孔封闭，此时为胚孔封闭期(图1r)。

2.1.7 器官分化阶段

受精后10.82 h，在胚体的中部出现2对体节，此时为体节出现期(图1s)；受精后11.42 h，在头部中央两侧，有一对肾形的突起，即眼的原基，体节为4～6对，此时为眼原基出现期(图1t)；受精后12.45 h，此时卵黄囊近圆形，随着头尾的延伸，胚体的头尾更接近，头尾约环抱卵黄周长的5/6，眼囊清晰，呈长椭圆形，体节为10～12对，为眼囊期(图1u)；受精后13.47 h，胚体出现似椭圆形耳囊，此时体节14～15对(图1v)；受精后15.08 h，卵黄囊呈肾形，尾芽出现在胚体后端腹面，渐渐与卵黄囊游离，眼囊变圆，此时为尾芽期，具尾泡(图1w)；受精后16.95 h，在眼杯口出现椭圆形的晶体，可见胚体开始微弱的间歇性颤动，此时为晶体出现期(图1x)；受精后17.60 h，尾部已离开卵黄囊，出现尾鳍，肌肉收缩摆动幅度变大，为肌肉效应期；受精后18.52 h，眼囊圆形，晶状体非常清晰但无色素沉积，在头部下方形成半透明围心腔，细胞排列成串，胚胎出现血液循环，此时为心脏出现期(图1y)，可明显观察到头后部膨大神经管，椭圆状耳囊已前移，位于心脏的斜后方，胚体摆动加剧，收缩频率为69次/min；受精26.65 h后，可见胸鳍原基(图1z)，呈半圆弧形，卵黄囊体积缩小，尾部游离变长，约占胚体的1/4。受精后28.42 h，嗅窝形成(图1aa)，耳囊前移至眼后方，肌节明显增多，由于胚体在卵膜中剧烈摆动，卵黄囊后端明显可见具3～4道褶皱；受精后32.32 h，血液为淡红色；受精后34.15 h，尾略向背方举起，胚体在卵膜内转动，尾部和头部不停地顶撞卵膜，头部呈90°弯向腹部，卵黄囊体积进一步缩小，前部为一球形，后部延长呈棒状，尾部游离部分约占胚体的1/3；受精后39.23 h，有血液流经一螺旋状结构，为鳃弧。

2.1.8 出膜期

受精后41.40 h，开始出膜，44.83 h后半数胚体出膜，受精后49.55 h，基本均已出膜。刚出膜的仔鱼无色透明，全长为(4.54±0.04) mm，肌节36～37对，血液红色，心脏位于到卵黄囊前方，鳃弧明显，可见血液流经此处，大部分眼囊无黑色素沉积，耳囊前移至眼后方，胸鳍褶扁铲状，未游离，胸鳍下方出现雏形鳔，腹鳍褶与臀鳍褶之间有一明显分界线，为肛凹，一消化管从头部连通至肛凹处，尾呈圆形。卵黄囊较大，呈现前粗后细的棒状，其侧面有血管的分布，为仔鱼输送营养(图1bb)。

表1 四川华鳊胚胎发育时期及主要特征(25±0.5) ℃Tab.1 Time sequence and characteristics of embryonic development stage in Sinibrama taeniatus (25±0.5) ℃

(续表1)

发育时期Developmental stage 受精后时间/hTime after fertilization主要特征Developmental characteristics图序Figure sequence眼囊期Optic vesicle stage12.45头尾约环抱卵黄周长的5/6,眼囊清晰,呈长椭圆形,体节为10～12对1u耳囊出现期Appearance of ear vesicle13.47胚体出现似椭圆形耳囊,体节14～15对1v尾芽期Tail bud stage15.08尾芽出现在胚体后端腹面,渐渐与卵黄囊游离,形成尾芽,肌节22对1w晶体出现期Appearance of eye len16.95胚体继续延长,尾部与卵黄囊游离的部分继续伸长,在眼杯口出现圆形的晶体1x肌肉效应期Muscular effect stage17.60晶体清晰,尾部已离开卵黄囊,出现尾鳍,脊索明显,肌肉收缩摆动幅度变大—心脏出现期Appearance of rudimental heart18.52卵黄囊前上方,细胞排列成串,即心脏原基,跳动节律较慢,血液无色1y胸鳍原基出现Rudimental pectral fin stage26.65可见胸鳍原基,胸鳍原基后下方有一长条锥形的鳔原基,古维尔氏管与胚体呈90°分布于卵黄囊前部,血液为淡黄色1z嗅窝形成Olfactory nest stage28.42嗅窝形成,耳囊前移至眼后方,肌节明显增多1aa鳃弧Branchial arc stage39.23胸鳍原基呈扁铲状伸向后侧,长锥形的鳔原基变大,此时有血液流经一螺旋状结构,为鳃弧—初孵仔鱼Newly hatched larva44.83无色透明,全长为(4.54±0.04) mm,肌节36～37对,可见鳔雏形,腹鳍褶与臀鳍褶之间有一明显分界线,为肛凹,消化管从头部连通至肛凹处1bb

注：表中的“—”代表胚体在卵膜内摆动剧烈，肉眼可见其特征，无法拍照记录.

Note: the “—” in the table shows that the embryo oscillates so violently in the egg membrane that its characteristics are not to be photographed even visible by the naked eyes.

2.2 不同温度对四川华鳊胚胎发育影响

2.2.1 不同温度下胚胎的受精率、孵化率、畸形率及成活率

计算得到不同温度下胚胎的受精率、孵化率、畸形率及成活率(表2)。随着温度的升高，四川华鳊胚胎的受精率和孵化率呈先升后降的趋势。16 ℃下，四川华鳊的胚胎在原肠阶段全部死亡，其余各温度组胚胎的受精率均较高。由此可见，温度过低，卵子无法完成受精。31 ℃组四川华鳊胚胎的受精率显著低于19、22、25、28 ℃组(P<0.05)，表明温度较高，受精率会降低。19 ℃下受精率为97.17%，其孵化率仅30.00%；31 ℃受精率为94.17%，其孵化率为79.11%；25 ℃下孵化率达到最大，为96.13%。说明了温度对四川华鳊胚胎孵化率的影响很大。

19 ℃下出膜的仔鱼畸形率较高，达87.19%，表现为仔鱼鱼体弯曲，出膜后陆续死亡，成活率仅9.14%；22、25、28 ℃组胚胎畸形率较低，组间无显著性差异(P>0.05)，25 ℃的仔鱼成活率最高，达99.13%；31 ℃下胚胎畸形率明显高于22、25、28 ℃(P<0.05)，约为28 ℃下胚胎畸形率的2倍，其成活率显著低于22、25、28 ℃组的仔鱼成活率(P<0.05)。可见，温度对胚胎致畸形影响作用大，温度过低或过高，均会导致畸形率升高，成活率降低。

2.2.2 不同温度对胚胎发育速度的影响

温度对四川华鳊胚胎发育速度影响的结果见表3，结果显示：

(1)16 ℃下胚胎发育到原肠阶段全部死亡，在19～31 ℃内，随着温度上升，整个胚胎发育各阶段及总孵化历时逐渐缩短，各温度组下胚胎孵化过程总历时均差异显著(P<0.05)，31 ℃下胚胎发育速度最快，孵化历时30.62 h，比19 ℃温度组缩短了46.31 h，22 ℃温度组耗时是31 ℃温度组的2.07倍。

(2)胚胎的器官分化阶段用时最长，占整个胚胎孵化历时72.53%～77.07%，且各温度组的器官分化阶段历时均有显著差异(P<0.05)。囊胚阶段是耗时第二长的阶段，所需时间大约是器官分化的11%(10.74%～11.57%)，且各温度组的囊胚阶段历时也均有显著差异(P<0.05)。

(3)其他几个阶段耗时都比较少，加起来不超过胚胎发育总时间的20%。

(4)四川华鳊的整个胚胎发育过程表明，温度对胚胎发育所经历的时间有显著影响，基本呈现发育时长与温度呈负相关。通过胚胎的发育速率(x)与孵化温度(y)的分析(图1)，得出线性关系y=550.76x+12.69(r2=0.9807，P<0.05)，可知四川华鳊的生物学零度为12.69 ℃。

图1 四川华鳊胚胎发育Fig.1 Embryonic development of Sinibrama taeniatus a.成熟卵； b.受精卵； c.胚盘隆起； d.2细胞期； e.4细胞期； f.8细胞期； g.16细胞期； h.32细胞期； i.64细胞期； j.多细胞期； k.囊胚早期； l.囊胚中期； m.囊胚晚期； n.原肠胚早期； o.原肠胚中期； p.原肠胚晚期； q.神经胚期； r.胚孔封闭期； s.体节出现期； t.眼基出现期； u.眼囊期； v.耳囊出现期； w.尾芽期； x.晶体出现期； y.心脏出现期； z.胸鳍原基出现； aa.嗅窝形成； bb.初孵仔鱼. a.mature egg; b.fertilized egg; c.germinal disc; d.2-cell stage; e.4-cell stage; f.8-cell stage; g.16-cell stage; h.32-cell stage; i.64-cell stage; j.morula stage; k.early blastula stage; l.middle blastula stage; m.late blastula stage; n.early gastrula stage; o.mid-gastrula stage; p.late gastrula stage; q. neurula stage; r.blastopore closed stage; s.segmentation stage; t.optic rudiment stage; u.optic vesicle stage; v. appearance of ear vesicle; w.tail bud stage; x.appearance of eye len; y.appearance of rudimental heart; z.rudimental pectral fin stage; aa.olfactory nest stage; bb.newly hatched larva.

表2温度对胚胎的受精率、孵化率、畸形率及成活率的影响%

Tab.2 The effect of temperature on the fertility, hatching, abnormality andsurvival rates of fertilized egg of Sinibrama taeniatus embryos

注：数据用平均值±标准差表示，相同列上带上不同的上标的数值间有差异显著(P<0.05),下同.

Note: the data are expressed as average mean±standard deviation, and the means with different superscripts in the same line are significantly different (P<0.05),et sequentia.

表3 不同温度下四川华鳊的胚胎各阶段发育历时、有效积温值Tab.3 Development time and effective accumulative temperature of Sinibrama taeniatus embryos at various stages

图2 发育速率与温度的关系Fig.2 The relationship between development rate and temperature

3 讨 论

3.1 四川华鳊胚胎发育特征

四川华鳊卵具黏性，卵裂类型为盘状分裂。根据四川华鳊胚胎发育过程的形态特征并结合已有的分期标准，将胚胎发育过程分为8个连续发育阶段28个时期。大多数鱼类[17-20]的胚胎发育在器官分化阶段之前发育时序相同，而在器官分化阶段之后各特征的出现顺序及发育程度有所不同。如四川华鳊的肌节出现于眼囊期之前，而齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[21]肌节出现于眼囊期之后；四川华鳊尾芽出现于耳囊之后，草金鱼(Carassiusauratus)[22]尾芽出现在耳囊形成之前；四川华鳊胚胎在晶体出现期时其尾部已经游离，短须裂腹鱼(S.wangchiachii)[17]则在晶体出现期之前尾部开始游离，中华倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[19]和翘嘴红鲌(Erythroculterilishaeformis)[23]在晶体出现后的心脏出现期尾部才开始游离。出膜时四川华鳊尾部约占全长的1/3，翘嘴鲌(Culteralburnus)[24]和短须裂腹鱼[17]尾部约占全长比小于1/3。这些器官形成的差异可能跟物种本身遗传因素有关，同时，也可能是生存环境的作用，使鱼类在胚胎发育过程获得更适应环境的生理条件。

3.2 温度、卵径大小与胚胎孵化历时的关系

水温在19～31 ℃内，四川华鳊胚胎孵化历时为30.62～76.93 h。结果显示，随着温度升高，胚胎发育速度加快，胚胎孵化历时逐渐缩短，与对斑鳜(Sinipercascherzeri)[25]、斑马鱼(Daniorerio)[26]、大口黑鲈(Micropterussalmoides)[27]等的研究结果一致。由此可见，胚胎在适宜温度范围内，孵化历时与水温呈正相关。因此，在生产上可通过调控温度来调节胚胎的发育进程。

3.3 温度对胚胎发育的影响

鱼类胚胎发育过程对水温条件比较敏感，高温或者低温环境下，都会导致胚胎发育畸形或者滞育，甚至胚胎死亡[29]。因此，鱼类胚胎发育的适宜环境温度的探索，是研究鱼类繁育的关键。

然而，生物的发育一般开始于某一个温度值，低于这个温度时生物并不会开始发育，这个温度值就是生物学零度[35]。四川华鳊胚胎发育的生物学零度为12.69 ℃，水温在16 ℃时，胚胎发育至原肠胚阶段全部死亡；玫瑰无须鲃(Puntiusconchonius)[36]的生物学零度为12.35 ℃，其胚胎在16 ℃ 下发育至神经胚期全部死亡；似刺鳊(Paracanthobramaguichenoti)[37]的生物学零度为9.50 ℃，在10 ℃下胚胎卵裂异常死亡。可知，当水温与生物学零度接近时，胚胎发育不正常或者无法完成受精过程，最终死亡。

19 ℃时四川华鳊胚胎的孵化率为30.00%，其畸形率高达87.19%，所有胚胎出膜后能存活的仔鱼9.14%，与鳜鱼(S.chuatsi)[38]的研究结果相似。低温胁迫可引起细胞凋亡和肌肉发育的阻滞，进而导致发育畸形[39]。19 ℃下四川华鳊胚胎发育速度缓慢，胚胎孵化历时较长，可能是低温降低了胚胎发育过程中孵化酶的活性，继而抑制了相关代谢活动，影响胚胎发育的速度[40]。当温度升至31 ℃时，胚胎发育速率更快，但其受精率、孵化率、成活率降低，畸形率明显升高，原因可能是胚胎孵化环境的温度过高，孵化酶以及细胞膜上相关酶失活，受精卵细胞膜的渗透性使得卵裂过程或器官分化过程出现紊乱[41]，导致胚胎出现畸形概率增加，甚至造成死亡。31 ℃下四川华鳊的胚胎成活率较高，而斑鳜[25]在30 ℃下胚胎发育至原肠中期全部死亡，33 ℃对淇河鲫[42]胚胎是致命的，说明不同种鱼的胚胎发育临界温度不同，显然四川华鳊的胚胎发育的上限高于31 ℃，可以设置更高的温度梯度，获得四川华鳊的胚胎发育临界温度的上限。

本研究结果显示，水温在22～28 ℃时，四川华鳊的受精率、孵化率、成活率均较高，畸形率较低，为四川华鳊胚胎发育的适宜温度，有效积温为522.35～595.11 ℃·h。然而，综合受精率、畸形率、成活率等所有因素，在生产上建议四川华鳊的孵化温度控制在约25 ℃为最佳。