囊胚解冻移植周期中胚胎形态学评分对临床妊娠结局的影响

王 瑾,吕 睿,陈海霞,穆晓环,白晓红

(天津医科大学总医院妇产科生殖医学中心,天津市女性生殖健康与优生实验室,天津 300052;*通讯作者,E-mail:bxhjj@163.com)

随着辅助生殖技术的进步、冷冻保存技术的改进以及胚胎移植时间的选择,使得过去近20年来冷冻胚胎移植的使用大大增加[1]。同时,胚胎培养条件的改善使囊胚期的胚胎得到更多的使用[2-4]。目前体外培养为囊胚移植提供了最大的支持,这就为实现健康怀孕和安全分娩的可能提供了技术支持。同时,囊胚移植后的种植率和妊娠率高[5],所以越来越多的中心也优先考虑囊胚移植。另外,胚胎在体外的生长过程中,需要一个统一的标准来评价其发育状态的好坏,所以目前大部分中心都是利用胚胎/囊胚的形态学来评定胚胎/囊胚是否优质,但是形态学的评分是人为主观、且只评价观察当时的胚胎/囊胚的状态,并不能完全代表胚胎/囊胚的发育潜能。对于获卵数较多或者第3天(D3)拥有较少形态学高评分胚胎的患者,囊胚培养就非常必要。囊胚培养延长了胚胎的体外培养时间,提供了更长时间自我选择的机会,使得胚胎能够充分的发挥发育的潜能[6]。针对D3形态学评分较低的胚胎行囊胚培养后,囊胚形态学评分对解冻移植临床妊娠结局影响的研究较少。本研究通过分析囊胚解冻移植周期的囊胚及其D3胚胎形态学评分,探讨D3形态学评分较低的胚胎形成囊胚的发育潜力及其移植后的临床妊娠结局,同时为解冻周期的囊胚选择提供参考依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象

回顾性分析自2019年1月至2020年4月在天津医科大学总医院妇产科生殖中心解冻移植周期共602个周期和新鲜周期囊胚培养D3高评分111个周期和低评分613个周期。

纳入标准:①移植D3优质胚胎的解冻周期;②至少移植1枚囊胚的解冻周期;③D3高评分纳入标准:Ⅰ级和Ⅱ级的胚胎;D3低评分纳入标准:2PN来源,卵裂球数目4-13个,胚胎碎片≤25%,无多核情况。

本研究根据D3胚胎和囊胚的评分情况进行分组，具体见图1。D3组为D3优质胚胎组(478例),D3胚胎继续培养形成的囊胚分为D3形态学评分高组(HD3B组,58例)和形态学评分低组(LD3B组,66例)。再根据囊胚的形态学评分将HD3B组和LD3B组分为H1/L1组优质囊胚组(23/8例),H2/L2组优质+非优质可用囊胚(1 ∶1)组(1/2例),H3/L3组非优质可用囊胚组(34/54例),H4/L4组劣质囊胚组(0/2例)。

本回顾性分析中所有体外操作都是不孕夫妇在接受辅助生殖治疗中的常规操作，符合人类辅助生殖技术的规范和要求，且在不孕夫妇知情同意的情况下进行。

图1 周期分组流程Figure 1 A process of grouping

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培养方法 本中心的所有胚胎培养液均采用商品化的G-seriesTM培养液(Vitrolife,瑞典)。胚胎培养至D3移植或冷冻后,将剩余养囊胚胎移至G2TM-plus液滴中培养至D5或D6。全部培养过程都置于37 ℃,89%N2、6%CO2和5%O2的三气培养箱中。

1.2.2 D3胚胎评分标准 本中心根据Peter评分标准[7]对D3胚胎进行评分。Ⅰ级:7-9细胞,卵裂球大小均匀,形状规则,胞质均匀,无粗颗粒现象,胞质内碎片<10%;Ⅱ级:7-9细胞,卵裂球大小稍有不均,形状稍有不规则,稍有颗粒现象,碎片10%-15%之间;Ⅲ级:7-9细胞,卵裂球大小明显有不均,形状明显不规则,明显有颗粒现象,碎片15%-25%之间;Ⅳ级:卵裂球极不均匀,形状极不规则,胞质极不均匀,颗粒现象严重,碎片>25%。本研究将Ⅰ级和Ⅱ级定为评分高的胚胎。

1.2.3 囊胚评分标准 根据Gardner评分标准[8]对囊胚评级。本研究将优质囊胚定义为3级及以上,且内细胞团及滋养层细胞评级都在B级及以上的囊胚;而2级或3级且内细胞团及滋养层细胞有一处评级在C级定义为非优质可用囊胚;2级以下的囊胚为劣质囊胚。

1.2.4 胚胎及囊胚的冷冻与解冻 本实验室均实行玻璃化冷冻方法进行胚胎及囊胚冷冻。冷冻及解冻的操作均按照日本加藤公司的玻璃化冷冻、解冻套装说明书进行。

1.2.5 子宫内膜的准备 子宫内膜的准备方案分为:①自然周期;②人工周期;③降调+人工周期。

1.2.6 移植后妊娠结局的判断 移植后28 d阴道超声观察到孕囊判定为临床妊娠;移植后14 d血液β-hCG的含量>10 IU/ml判定为生化妊娠,含量为≤10 IU/ml判定为未妊娠。

1.3 观察指标及判定标准

总结分析女性患者一般临床资料、助孕指标及囊胚形成率、可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率、非优质可用囊胚率、解冻存活率、解冻完整率、种植率、临床妊娠率、生化妊娠率和流产率。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 新鲜周期D3胚胎囊胚形成情况

新鲜周期将挑选D3胚胎冷冻或新鲜移植后的不同评分胚胎进行囊胚培养。统计本中心的囊胚培养情况,共395枚D3形态学高评分的胚胎进行囊胚培养,囊胚形成率、可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率、非优质囊胚形成率和劣质囊胚形成率分别为60.51%(239/395),49.11%(194/395),19.25%(46/239),61.92%(148/239)和18.83%(45/239);D3低评分胚胎2 415枚进行囊胚培养,囊胚形成率、可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率、非优质囊胚形成率和劣质囊胚形成率分别为14.74%(356/2 415),12.7%(307/2 415),8.99%(32/356),77.25%(275/356)和13.76%(49/356)。两组的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率和非优质囊胚形成率差异均有统计学意义(P<0.001或P<0.05),劣质囊胚形成率差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

表1 新鲜周期D3胚胎囊胚形成情况

2.2 解冻移植周期各组患者一般临床资料情况比较

在解冻移植周期中,移植D3优质胚胎的D3组,移植上述新鲜周期D3不同评分形成囊胚的HD3B组和LD3B组,将三组患者的女方年龄、女方不孕年限、女方的不孕类型以及解冻移植周期的内膜准备方案、移植日的内膜类型和内膜厚度进行比较,统计数据发现,在上述方面,除在年龄方面差异有统计学意义(P<0.05),其余方面差异均无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.3 解冻移植周期三组临床妊娠结局情况比较

三组间解冻存活率和解冻完整率比较差异均无统计学意义(P>0.05),但HD3B组和LD3B组平均移植胚胎数D3组差异有统计学意义(P<0.001)。HD3B组和LD3B组移植的囊胚质量差异有统计学意义(P<0.01);三组间种植率差异有统计学意义,HD3B组和LD3B组种植率高于D3组(P<0.001或P<0.01),而HD3B组与LD3B组间比较差异无统计学意义(P>0.05);HD3B组临床妊娠率高于D3组(P<0.05),而LD3B组与其他两组比较差异无统计学意义(P>0.05);三组间流产率、生化妊娠率差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。

表2 解冻移植周期三组患者基本情况的比较

表3 解冻移植周期三组胚胎妊娠情况比较

HD3B组和LD3B组中评分同等级的囊胚移植后临床妊娠结局的比较H1组和L1组种植率和妊娠率分别比较,差异无统计学意义(P>0.05);H2组和L2组、H4组和L4组由于组中存在0个周期,所以不做统计学比较;H3组和L3组间种植率、妊娠率和流产率分别比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表4)。

表4 相同质量来源不同的囊胚解冻移植的临床妊娠结局比较

3 讨论

3.1 结果分析

新鲜周期中,形态学评分低的D3胚胎有一定形成囊胚的能力,并且形成非优质可用囊胚的比例较高,说明D3胚胎形态级别虽然低,但是仍然有一部分胚胎具有发育的潜力。

在囊胚解冻移植周期中,D3高评分胚胎形成的优质囊胚移植比例较高,而D3低评分胚胎形成的非优质可用囊胚移植比例较高,这与新鲜周期D3低评分胚胎形成非优质可用囊胚比例较高有关系。分析对比三组的基本临床信息,发现患者的年龄在三组中差异有统计学意义(P<0.05);平均移植胚胎数在三组间差异有统计学意义(P<0.001),这是因为囊胚每次移植数通常控制在1枚,而D3优质胚胎移植2枚的周期较多。三组间种植率差异有统计学意义(P<0.001),移植的囊胚组优于D3优质胚胎组,但囊胚组两组间差异无统计学意义(P=0.324);造成这个结果的原因,其一可能是D3高评分胚胎形成的囊胚组的患者年龄偏低;其二是囊胚本身的种植率优于D3优质胚胎,所以D3低评分胚胎形成的囊胚依然有较高的种植率。三组间临床妊娠率比较,差异有统计学意义(P=0.039),D3高评分胚胎形成的囊胚组高于D3优质胚胎组(P=0.024),D3低评分胚胎形成的囊胚组高于D3优质胚胎组(P=0.150)但低于D3高评分胚胎形成的囊胚组(P=0.480)。三组间流产率和生化妊娠率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。总结上述结果一方面证明解冻移植周期中,D3低评分胚胎形成的囊胚有很好的利用价值,有较高的种植率和妊娠率;另一方面,当患者解冻移植周期有对应上述三组胚胎/囊胚供选择时,D3高评分胚胎形成的囊胚最优,D3低评分胚胎形成的囊胚其次,最后选择移植D3优质胚胎。

对于解冻移植囊胚时,囊胚评分级别相同、D3评分不同的囊胚妊娠结局对比,种植率、临床妊娠率和流产率差异无统计学意义(P>0.05)。目前数据分析发现,囊胚期的评分级别相同,解冻移植周期的临床妊娠结局也是相似的。但是周期数较少,若要得出上述结论还需更多周期数据的支持。总之,D3低评分的胚胎形成的囊胚在不增加流产率的同时能够获得较好的种植率和妊娠率。进一步说明了D3低评分的胚胎形成的囊胚仍有较好的利用价值。

3.2 D3低评分的胚胎形成囊胚后解冻移植的意义

目前大部分中心都是利用胚胎的形态学来评定胚胎是否优质,D3胚胎在评定之后,新鲜周期选择冷冻或者移植;而剩余的评分低胚胎会选择继续体外培养,并且在许多文章中都报道获得了较好临床妊娠结局[9-13]。首先,胚胎在体外培养至囊胚期时,会将一些发育潜力弱,染色体异常的胚胎淘汰;其次,囊胚是胚胎发育的高级阶段,在自然生理状态下,胚胎早期在输卵管发育,当发育至囊胚阶段时移动到子宫腔内,所以囊胚期的胚胎与子宫内膜更同步,增加了囊胚移植的种植率和妊娠率[14]。

本研究通过对比D3不同评分胚胎形成囊胚的情况,发现评分低的胚胎仍有一定形成囊胚的能力,并且种植率和妊娠率都高于解冻移植D3高评分胚胎的周期。另外,D3不同评分胚胎形成的囊胚,在解冻移植后有较好的妊娠率和较低的流产率。表明了D3低评分的胚胎具有一定的发育潜能,所以囊胚培养保证了新鲜周期所有胚胎的充分利用;在解冻移植周期同时存在D3优质胚胎和囊胚的情况下,低评分的胚胎形成的囊胚可以优于D3优质胚胎使用。