裙带菜中不同分子质量岩藻多糖的理化成分和抗氧化性比较

于靓 刘婷婷 孟冬青 李倩倩 赵渝

摘  要： 从中国山东威海海域采收裙带菜（Undaria Pinnatifida）样品，利用乙醇浸提法对样品中的岩藻多糖粗品进行提取。采用透析的方法，制备分子质量小于1×104 u的低分子质量岩藻多糖分离物。测定了不同分子质量岩藻多糖分离物的硫酸盐、糖醛酸及其对1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基的清除能力。分析和比较了岩藻多糖粗提取物和分子质量小于1×104 u的岩藻多糖的理化成分和抗氧化活性。分析结果表明：粗提物的硫酸盐和糖醛酸含量略高于低分子质量岩藻多糖，其中粗提物中硫酸盐质量分数高达36.50%。与岩藻多糖粗提物相比，低分子质量岩藻多糖具有更高的一级和二级抗氧化能力。

关键词： 裙带菜; 岩藻多糖; 分子质量; 抗氧化活性

中图分类号： Q 539    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2020）06-0692-06

Abstract： The ethanol extraction method was used to extract fucoidan from the sample of Undaria pinnatifida collected from sea of Weihai，Shandong province，China.The ethanol extraction method was used to extract fucoidan from the samples.Low molecular weight fucoidan isolates with molecular weight less than 1×104 u were prepared by dialysis method.The sulfates，uronic acids，and their scavenging abilities on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and on hydroxyl radicals of fucoidans with different molecular weight were determined respectively.The physical and chemical constituents and antioxidant activities of the fucoidan crude extracts and fucoidans with molecular weight less than 1×104 u were analyzed and compared.The results showed that the sulfate and uronic acid content of the crude extract was slightly higher than that of low molecular weight fucoidan，and the sulfate mass fraction of the crude extracts was as high as 36.50%.Compared with the crude extracts，the fucoidan of low molecular weight has higher primary and secondary antioxidant capacity.

Key words： Undaria pinnatifida; fucoidan; molecular weight; antioxidant activity

0  引  言

巖藻多糖是一种富含硫酸基的水溶性杂多糖[1]，可以从棕色海藻（如Undaria pinnatifida，Turbinaria conoide等）中获得[2]。岩藻多糖是由岩藻糖、糖醛酸和硫酸盐等组成的细胞壁多糖[3]。

近年来已报道了岩藻多糖具有抗增殖活性[4]，其中硫酸盐被证明是重要的活性物质[5]和关键因素[6]。岩藻依聚糖中的糖醛酸含量对岩藻多糖的抗凝活性起着重要作用[7]。同时，岩藻多糖具有多种潜在医学价值[8]，例如抗氧化活性、抗肿瘤、抗炎和抗病毒。抗氧化活性是岩藻多糖生物学特性的重要指标[9]。最近的研究表明：低分子质量的岩藻多糖可能具有更好的抗氧化活性[10]。

本文作者报道了从山东威海裙带菜（Undaria pinnatifida）中提取的岩藻多糖粗品（WHR）和透析获得的分子质量小于1×104 u的岩藻多糖分离物（WH-10）两种的岩藻多糖样品。比较了WH-R和WH-10的硫酸盐含量、糖醛酸含量、一级和二级抗氧化能力。

1  材料与方法

1.1 材  料

新鲜裙带菜，采摘自山东威海;化学试剂均为分析纯。

实验所用仪器为T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;JA200SA电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）;TG1650-WS高速离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）;10ND-冷冻干燥机（上海一恒科学仪器有限公司）;HH-4数显恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）;KQ5200DB超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 岩藻多糖的制备

将在山东威海采收的裙带菜，用净水冲洗，通过烘箱加热，研磨干燥得到粉末状样品，室温储存。随后，将研磨的裙带菜粉末在70 ℃的热水中浸泡过夜。离心后，加入质量分数为2%的CaCl2粉末，在4 ℃下隔夜保存，将海藻酸盐离心去除，得到滤液。在滤液中加入无水乙醇，离心回收乙醇沉淀的岩藻多糖。冷冻干燥，得到岩藻多糖粗提物粉末（WH-R）。4 ℃下保存备用。

采用透析法获得分子质量小于1×104 u的岩藻多糖样品。将1.5 g粗制岩藻多糖溶于50 mL水中。将溶液放入1×104 u透析袋中并在4 ℃下保持3 d。收集透析袋中的岩藻多糖溶液，冷冻干燥，得到分子质量小于1×104 u的岩藻多糖粉末。

1.3 硫酸盐含量的测定

将2 g明胶溶解在400 mL去离子水中以制备凝胶状流体。

将2 g氯化钡溶解在凝胶状液体中以制备BaCl2明胶试剂。

使用硫酸钾溶液构建标准曲线。将硫酸钾的质量浓度配置为100 μg?mL-1。依次分别量取对照品溶液0，1.2，2.4，3.6，4.8，6.0，7.2，8.4，9.6 mL。分别加水至10 mL。取0.1 mL以上各浓度溶液到试管中，向其中加入1.9 mL质量分数为3%的三氯乙酸（TCA）和0.5 mL的BaCl2明胶试剂。将反应物涡旋并转移到比色皿中，然后在360 nm（波段）下测量样品的吸光度（OD）值。以吸光度值为纵坐标标目，以硫酸盐质量浓度为横坐标标目，建立标准曲线。

两种岩藻多糖样品分别溶解在5 mL HCl中制备试样。使样品在90 ℃下水解2.5 h。取0.1 mL水解的样品移液到15 mL离心管中，向其中加入1.9 mL质量分数为3%的TCA和0.5 mL的BaCl2明胶试剂。将反应混合物涡旋并转移到比色皿中，然后在360 nm下测量岩藻多糖样品的吸光度值。对照标准曲线得到岩藻多糖样品的硫酸盐质量浓度。

1.4 糖醛酸含量的测定

依次分别量取对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL。将试管放入冰水浴中冷却，加入0.025 mol/L-1硼砂硫酸溶液5 mL。沸水浴加热10 min，迅速冷却后，加入0.2 mL咔唑-无水乙醇。继续使用沸水浴加热15 min。试管温度冷却至室温后，在530 nm处检测岩藻多糖样品的吸光度值。以吸光度值为纵坐标标目，以糖醛酸质量浓度为横坐标标目，制得标准曲线。

将300 mg岩藻多糖样品置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度。量取1 mL稀释后的样品溶液，置于100 mL量瓶中，再次加水稀释至刻度，量取1 mL。加入物质的量浓度为0.025 mol?L-1的硼砂硫酸溶液5 mL。沸水浴加热10 min，迅速冷却后，加入0.2 mL咔唑-无水乙醇。继续使用沸水浴加热15 min。待试管温度冷却至室温后，在530 nm处检测岩藻多糖样品的吸光度值，重复3次。对照标准曲线测得岩藻多糖样品糖醛酸的质量浓度。

1.5 抗氧化性测定

1.5.1 1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除能力测定

取40 mg DPPH溶解在1 L乙醇溶液中制备DPPH工作液。分别配置质量浓度为10，20，30，40，50 μg?mL-1的Trolox（维生素 E）溶液，各取3 mL不同质量浓度的Trolox溶液与3 mL的DPPH工作液混合并涡旋，在室温避光环境中反应40 min。在517 nm处读取吸光度值。以VE溶液的质量浓度为横坐标标目，以清除率为纵坐标标目，制得Trolox標准曲线。

将2 mg样品溶解在1 mL去离子水中分别制得岩藻多糖试样。取3 mL岩藻多糖试样与3 mL的DPPH工作液混合并涡旋，并且在室温避光环境中反应40 min。在517 nm处读取其吸光度值，试样的DPPH自由基清除率

其中，A0为空白对照的吸光度值;A1为试样的吸光度值。

1.5.2 羟基自由基清除能力测定

反应物包含岩藻多糖或藻酸盐溶液（1 mg?mL-1，0.1 mL）、硫酸亚铁（9 mmol?L-1，1 mL）、过氧化氢（质量分数0.3%，1 mL）和水杨酸乙醇溶液（5 m mol?L-1，0.5 mL），然后在37 ℃下孵育30 min。在510 nm处测得岩藻多糖试样的吸光度值，试样的羟自由基清除率

其中，A0为空白对照的吸光度值;A1为岩藻多糖试样的吸光度值;A2为多糖的本底吸光度值。

2  结果与分析

2.1 硫酸盐含量测定结果

用氯化钡-明胶法测定了岩藻多糖中硫酸盐质量浓度的标准曲线，如图1所示。

按照图1的标准曲线对2种岩藻多糖样品（WH-R，WH-10）中硫酸盐的质量分数进行了测试，结果如表1所示。

根据中国医药保健品进出口商会团体标准T/CCCMHPIE 1.42—2018《植物提取物-岩藻多糖》要求，硫酸盐质量分数应大于15%。由表1可知，两种岩藻多糖样品的硫酸盐质量分数为25%～40%，均符合标准。低分子质量岩藻多糖样品中的硫酸盐质量分数小于岩藻多糖粗品的，可能的原因是纯化过程中损失了较多的硫酸盐，即硫酸基团多存在于高分子岩藻多糖中。因此，来自威海裙带菜的高分子质量岩藻多糖更适宜作为抗凝功能性产品进行开发和利用。

2.2 糖醛酸含量测定结果

用葡萄糖醛酸作为标准品测定了岩藻多糖中糖醛酸质量浓度的标准曲线，如图2所示。

按照图2的标准曲线对2种岩藻多糖样品（WH-R，WH-10）中糖醛酸的质量分数进行了测定，结果如表1所示。

由表1可知：低分子质量的岩藻多糖（WH-10）中糖醛酸含量较低。高分子质量岩藻多糖（WH-R）更适用于降血脂功能性产品的开发和利用。

2.3 抗氧化性测定结果

2.3.1 DPPH清除能力测定

DPPH自由基清除法是一种省时、快速的抗氧化剂活性评估方法，常用于评估抗氧化剂分子清除自由基的潜力[11]。据文献[12]报道：岩藻依聚糖的抗氧化能力来源于向2，2-二苯基-1-苦基肼基提供氢原子的能力，从而形成2，2-二苯基-1-苦基肼。建立Trolox标准曲线，如图3所示。

对2种岩藻多糖样品（WH-R，WH-10）的DPPH自由基清除率进行了测定，得到Trolox质量浓度，结果如表2所示。

通过DPPH清除实验研究了 WH-R，WH-10的一级抗氧化能力。由表2可知：WH-10的一级抗氧化能力高于岩藻多糖粗提物的。据文献[12]报道：岩藻多糖对DPPH自由基的清除能力与所含硫酸盐质量浓度呈正相关，但是依据之前的实验结果，WH-10的硫酸盐含量低于岩藻多糖粗提物，表明岩藻多糖的抗氧化能力可能和其含有的其他物质相关，这一点有待进一步研究。

2.3.2 羟基自由基清除能力测定

通过对羟基自由基清除实验研究了WH-R，WH-10的二级抗氧化活性。由表2可知：降低岩藻多糖的分子质量可增强其对羟基自由基的清除能力，表明从威海裙带菜中分离的低分子质量岩藻多糖可作为有效的羟基自由基清除剂，并有可能被用作食品加工中的功能性成分。

3  结  论

利用中国山东威海海域采摘的裙带菜样品制备岩藻多糖粗提物和分子质量小于1×104 u的低分子质量岩藻多糖。对两种不同分子质量岩藻多糖的硫酸盐含量、糖醛酸含量进行了分析，同时检测了岩藻多糖样品的抗氧化能力。结果表明：从中国山东威海地区裙带菜提取的岩藻多糖粗品和低分子质量岩藻多糖就理化成分和抗氧化能力而言有一定的差异。例如，岩藻多糖粗提物的硫酸盐含量和糖醛酸含量高于分子质量小于1×104 u的岩藻多糖分离物，因此高分子质量岩藻多糖更适宜作为抗凝产品的开发原料。但低分子质量岩藻多糖对DPPH自由基的清除能力以及对羟基自由基的清除能力略高于岩藻多糖粗品。这突出了从裙带菜中分离的褐藻糖胶的潜力，可用作食品加工生产中的功能性成分。

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（責任编辑：顾浩然，包震宇）