三氯生对雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因表达的影响

刘旭昊，祖恩普，王 凡

（洛阳师范学院，河南 洛阳 471000）

三氯生（Triclosan，TCS）化学名称为2,4,4′-三氯-2′-羟基二苯醚，微溶于水，易溶于有机溶剂和碱液。为广谱抗菌剂和杀菌剂，广泛应用于肥皂、牙膏、化妆品等个人护理品，医疗杀菌剂等医疗用品，纤维产品、丝质产品等纺织用品中。随着日用消费品的大量使用，TCS 广泛存在于自然界中，现已于污水处理厂、污泥、河口、河流等检测到TCS，在污水处理厂进、出水浓度分别高达86.2、2.7 μg/L，自然河流和沉积物中分别高达2.3、2.7 μg/kg[1]。由于TCS 具有一定的稳定性、生物蓄积性和弱毒性等特点，其潜在威胁已经成为国内外研究焦点之一[1-4]。目前，关于TCS 毒理学研究已有大量报道，李林朋等[5]在TCS 对人体肝细胞DNA 损伤研究中证实，低浓度TCS 会导致DNA 损伤。郑欣等[6]研究表明，TCS 会导致生物体组织发生突变和癌变，并对生物体内分泌系统有干扰性。陈建军等[7]研究发现，TCS 对硬骨鱼类有潜在遗传毒性和生理毒性。迄今，关于TCS 对鲤科鱼类肝胰脏细胞凋亡影响的研究报道较少。

斑马鱼（Danio rerio）为一种常见的模式生物，广泛用于遗传、药理学、毒理学和环境监测等领域的研究[8-9]。肝脏是鱼类的重要代谢器官和解毒器官，可在鱼类早期发育过程中降低外来毒物的毒性效应[10]。本研究以斑马鱼为材料研究TCS 对雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因表达的影响，有助于揭示TCS 对硬骨鱼类肝胰脏损伤的相关分子机制，为水体中TCS 的污染管控提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验用斑马鱼购于上海诚信渔场，体长1.5～2.1 cm。将斑马鱼放在60 L 水族箱中驯养，不间断充氧（DO ＞ 5 mg/L），每天早晚各投食1 次，并定时清理食物残渣和鱼的排泄物，每天换水1 次，换水量为1/2，驯养用水为曝气72 h 的自来水。水温(22±3) ℃，pH 6.8±0.2。整个驯养期间斑马鱼无死亡。取驯养的体质量 (0.06 ± 0.01) g、体长 (1.62±0.31) cm、行动比较敏捷活泼、状态较佳的鱼进行慢性TCS 暴露实验。

1.2 实验试剂

TCS，美国Sigma，纯度 ＞ 98.0%；二甲基亚砜（DMSO），天津紫明化工有限公司；2 g/L TCS母液，由DMSO 溶解TCS 配制而成；总RNA 极速抽提试剂盒，上海飞捷生物技术有限公司；反转录试剂盒，日本东洋纺生物科技有限公司；BestarSybr Green qPCR master mix，德国DBI 公司；引物序列由华大基因合成。

1.3 实验设计

TCS 对斑马鱼96 h 半致死浓度（LC50）为0.34 mg/L[11]，据此，设置一个空白对照组和3 个质量浓度分别为0.017、0.034、0.068 mg/L 的TCS 处理组，3 个处理组分别用TCS 母液配制而成，浓度分别为LC50的1/20、1/10、1/5。空白对照组和处理组中DMSO 体积分数为0.07%。每组设置两个平行组，每个水族箱水量为20 L，投放斑马鱼100 尾；水质指标同驯养。然后以半静态染毒法（每天换水10 L，同时补充相应的染毒液）对斑马鱼进行连续染毒。每天定时投放饲料及清除排泄物。

1.4 样本的制备

斑马鱼生命周期为4 个月左右，本暴露实验采用2 月龄斑马鱼。为探讨TCS 对斑马鱼从幼龄阶段到成龄阶段肝胰脏细胞凋亡的影响，因此进行了42 d 的TCS 连续染毒试验，暴露试验结束时，每缸死鱼尾数均小于5%，且染毒组和对照组无显著差异。然后，选出生长状况良好的斑马鱼进行解剖。每个浓度组取6 个样本（两个平行缸分别取3 个样本），每个样本由随机取的5 尾雌性斑马鱼的肝胰脏组成。然后迅速转移并保存在超低温冰箱中用于后期凋亡相关基因表达的检测。

1.5 凋亡相关基因表达的检测

1.5.1 引物序列β-actin、Bax、MDM2、p53和Bcl-2基因的引物序列参考文献[12]，详见表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Sequences of PCR primer

1.5.2 RNA 的提取与反转录 按照总RNA 极速抽提试剂盒提供的方法，提取雌性斑马鱼的肝胰脏组织总RNA。用凝胶电泳分析RNA 质量，并用超微量分光光度计检测其纯度。对质量好且纯度高的RNA 样本进行反转录反应。

1.5.3 普通PCR 将反转录所得cDNA 加入目的基因和内参基因的上下游引物，2×Taq MasterMix 及无菌水，制备25 μL 反应体系，根据普通PCR 步骤进行扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测各基因的表达结果。

1.5.4 实时荧光定量PCR 用实时荧光定量PCR仪分析各基因溶解曲线发现，内参β-actin及目的基因Bcl-2、p53、MDM2和Bax基因熔解曲线均为单峰，且单峰横坐标均为相同熔解温度，因此引物特异性良好，可以用来进行实时荧光定量PCR 反应。

用cDNA、目的基因和内参基因的上下游引物、BestarSybr Green qPCR master mix 及无菌水制备20 μL 的实时荧光定量PCR 反应体系，放入实时荧光定量PCR 仪中进行扩增。

从实时荧光定量PCR 扩增后的数据中提取荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（CQ值），用2-ΔΔt法计算目的基因的相对表达。采用最小显著差数法（LSD 法）分析对照组与处理组之间的差异，显著性水平α为0.05 或0.01。

2 结果与分析

2.1 目的基因和内参基因扩增

PCR 扩增结果如图1 所示，经比较各浓度组各基因与内参基因，以及同一基因对照组和TCS 处理组灰度值之比，发现p53在TCS 各处理组的表达升高；Bcl-2、MDM2和Bax基因表达降低。

2.2 三氯生对雌性斑马鱼凋亡相关基因表达的定量分析

如图2 所示，各TCS 浓度组Bcl-2基因与对照组相比表达极显著下调，0.017、0.034、0.068 mg/L组依次下调97.98%、75.97%、99.51%。各TCS 浓度组p53基因与对照组相比表达极显著上调，在TCS 浓度为0.017 mg/L 时上调最为明显，上调21.79倍。质量浓度为0.034、0.068 mg/L 时分别上调12.46倍和12.24 倍。

图1 不同TCS 浓度组内参及目的基因的表达Fig.1 Expression of genes in the groups with different TCS concentration

各TCS 浓度组MDM2基因与对照组相比均呈现极显著下调，0.017、0.034、0.068 mg/L 组依次下调99.26%、92.78%、75.69%。与对照组相比，TCS处理组的Bax基因亦极显著下调，0.017、0.034、0.068 mg/L 组依次下调94.26%、99.63%和98.89%。

同时，从图2 的结果也可以看出，Bax/Bcl-2比值呈现先升高，后下降再升高的趋势。

图2 TCS 对雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因表达的影响Fig.2 Effect of TCS on expression of apoptosis-related genes in female zebrafish hepatopancreas

3 讨论

3.1 TCS对斑马鱼肝胰脏中Bcl-2 与Bax 表达的影响

脊椎动物细胞凋亡是由多种基因共同控制的细胞程序性死亡，是维持生物正常生理过程和功能活动所必须的。Bcl-2 蛋白家族是细胞凋亡的重要调节蛋白。Bcl-2基因是一种抑制细胞凋亡的基因，位于内质网中，其表达量直接或间接影响内质网释放Ca2+，抑制凋亡[13]，从而保护细胞免受凋亡[14-15]。Bax基因为Bcl-2 家族的主要促凋亡基因。Bcl-2与Bax形成一个调控系统：当Bax形成同源二聚体时会诱导细胞的凋亡；而当细胞中的Bcl-2增多时会与Bax形成更加稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体，从而中和Bax的促凋亡作用[16]。在本研究中，TCS 处理的雌性斑马鱼肝胰脏中Bcl-2与Bax的表达量均显著下降。这可能是由于TCS 染毒液抑制了Bcl-2基因的表达，因Bcl-2基因表达的减少导致内质网释放大量的Ca2+，从而促进细胞的凋亡。这与刘林等[17]的纳米氧化锌对斑马鱼鳃中Bcl-2基因表达量影响的结果相一致。有研究表明，Bax/Bcl-2比值的升高可促进细胞凋亡的发生。本研究中Bax的表达量也极显著下调，但Bax/Bcl-2比例呈现先升高后下降再升高的趋势，进一步证实低浓度和高浓度组TCS 促进了斑马鱼肝胰脏细胞凋亡的发生。

3.2 TCS 对斑马鱼肝胰脏MDM2 和p53 表达的影响

MDM2基因是p53调控网络中的下游基因，参与细胞的生长、凋亡和细胞周期等生命过程，对维持生命活动的稳定有重要作用。MDM2可与p53的N 端区域结合，从而抑制其转录，并可将p53运出细胞核进入细胞质而降解[18-19]。p53为抑癌因子，其产物对多种下游基因有调节作用[20,21]。它在调控复杂的DNA 损伤系统中起转录因子作用，DNA 的损伤会引起p53表达量增高，其产物会激活下游抑制细胞周期素依赖性激酶活性，从而抑制细胞周期的进程[22]。本研究中，经TCS 处理的斑马鱼MDM2基因的表达量均显著下降，而p53基因的表达显著升高，在TCS 质量浓度为0.017 mg/L 时表达量最高，为对照组的20 倍。这进一步证实了TCS 加速雌性斑马鱼肝胰脏细胞凋亡的发生，与周迎芳等[23]的F-2 毒素对小鼠卵巢细胞凋亡影响结果一致。

综上，0.017 mg/L 的TCS 显著影响了雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因的表达，进而可能导致肝胰脏细胞凋亡的发生。该浓度高于自然河水中的最高质量浓度2.3 μg/L，但低于污水处理厂进水质量浓度86.2 μg/L，表明随着这类抗菌剂的大范围应用，可能会对水生态系统产生影响。