贮藏时间和加热温度对凡纳滨对虾虾仁ATP 关联化合物及品质的影响

孙鲁浩，毛伟杰，吉宏武，刘书成，高 静，邵海艳

（广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088）

鱼类死后发生的自溶反应会导致三磷酸腺苷（ATP）降解形成二磷酸腺苷（ADP）、腺苷酸(AMP)、肌苷酸（IMP）、肌苷（HXR）和次黄嘌呤 (HX）[1]。学界通常把HX、HXR 含量之和对ATP、ADP、AMP、IMP、HXR、HX 含量之和的比值（称为K值）作为评价鱼类鲜度的重要指标。蒋晨毓等[2]分析鳙（Aristichthys nobilis）和棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）在4 ℃和0 ℃贮藏过程中ATP 关联化合物的变化，并把K值作为鱼类鲜度指标进行研究。但在鱼类研究中通常也利用另外一些鲜度指标反映不同鱼种的鲜度，如G值（HX、HXR 含量之和对AMP、IMP、HXR 含量之和的比值）和P值（HX、HXR 含量之和对AMP、IMP、HXR、HX 含量之和的比值）[3]。但是K值、G值和P值可否用来表征对虾鲜度尚无定论。

此外，因为ATP 关联化合物不仅与虾肉的鲜度有关，而且与对虾的呈味有关。AMP 可抑制苦味，产生甜味。IMP 是鲜味物质，可与谷氨酸钠（MSG）一起使用，产生比MSG 更强的风味增强效果。两者已广泛用作食品增味剂。HX 和HXR 是呈现苦味或不良风味的物质[4]。加热对虾肉中ATP 关联物质变化的研究较多，TAKASHI 等[5]对比短时高温和蒸煮的加热方式对鱼中ATP 相关化合物的影响，短时高温的加热方式有利于IMP 含量的保留，减缓IMP降解。Shinya 等[6]研究发现，日本对虾（Penaeusjaponicus）在加热过程中AMP 含量增加，甜味也增加。贠三月等[7]以生熟虾肉和生熟虾头作为研究对象对ATP 关联化合物进行呈味研究。池岸英等[8]采用微波和水煮加热方式对凡纳滨对虾（L.vannamei）熟制品和生虾的ATP 关联化合物进行呈味性比较。Zhang 等[9]研究虾肉在微波和水浴加热过程中ATP 关联化合物降解。Xu 等[10]采用蒸汽加热的方式将虾肉蒸至不同的温度，并对ATP 关联化合物呈味性进行量化分析。但是不同贮藏期的对虾加热后ATP 关联化合物怎样变化，K值、G值和P值可否用来评价烹饪后对虾品质鲜有报道。

对虾的呈味物质由多种物质决定，难以从某种物质量的多少来判断其呈味特点，所以需同时结合感官评估进行判断。但是加热过程中ATP 关联化合物的变化与感官评定值之间是否有相关关系尚不清楚。本研究通过比较贮藏期的凡纳滨对虾在加热过程中的ATP 关联化合物含量的变化规律，阐明贮藏期的凡纳滨对虾加热前后的感官质量与K值、G值和P值的相关关系，为虾类品质评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

凡纳滨对虾购自广东省湛江市欢乐海洋水产部，平均体长（13.28±0.58）cm，平均体质量（25.10±0.62）g，鲜活对虾用海水在充氧条件下半小时内运回实验室，立即用冰水清洗，去头、壳，沥干表面水分后，部分进行鲜虾加热试验，将剩余虾用封口袋分成7 份，每份虾36 只，放入4 ℃冰箱冷藏。

试剂：ATP、ADP、AMP、IMP、HXR、HX标准品（纯度 ＞ 98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钾均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司（中国广东汕头市）；高氯酸为分析纯，购自天津政成化学制品有限公司；甲醇为高效液相色谱（HPLC）级，购自赛默飞世尔科技。

主要仪器：Agilent 半制备1200 高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司；TMS-G2-10-100ST-L 62Q0163 数显光纤温度探针，中国深圳欧普申光电科技有限公司。

1.2 加热方法

将贮藏在4 ℃冰箱的凡纳滨对虾虾肉，按照贮藏期（1、2、3、4、5、6、7 d）分别取出，样品在加热之前，首先保证样品的初始温度保持在4 ℃，将光纤温度探针插入凡纳滨对虾虾仁的第二腹节中心位置，通过光纤温度传感器监测样品的中心温度，然后缓慢将带有温度探针的虾肉，放入75 ℃的数显恒温水浴锅，分别在达到40、45、50、55、60、65、70 和75 ℃时取出，同时用未加热样品作对照。

1.3 ATP 关联化合物

1.3.1 样品制备 参考RYDER 和AGUSTINI 等的方法[11-12]，略有改动。将空白样品和加热过后的凡纳滨对虾虾肉用打浆机粉碎成糊状，称取虾肉（3个平行）2 g，加入10 mL 预冷在4 ℃体积分数10%的高氯酸溶液，用均质机充分均浆，再用5 mL 体积分数10%的高氯酸溶液清洗均质机转子两次，然后在10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，收集上清液，沉淀物再次加入10 mL 预冷体积分数的5%高氯酸溶液，用快速混均器使沉淀物混合均匀，浸提，离心，重复操作一次，合并上清液，用NaOH溶液中和并调pH 至6.5，用超纯水定容到50 mL，摇匀，取8 mL 样品放入-80 ℃备用，上机前放在冰水中解冻，再用0.22 μm 的微孔水相膜过滤，用于HPLC 进样分析。

1.3.2 ATP 关联化合物定量分析 色谱柱是COSMOSIL5C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色谱柱；流动相A 为CH3OH 溶液，B 为0.05 mol/L KH2PO4和0.05 mol/L K2HPO4混合溶液，pH 调至6.5；C 为超纯水；将甲醇用0.22 μm 的有机相膜抽滤，水溶液和盐溶液用0.22 μm 的水相膜抽滤，并进行超声脱气；柱温：25 ℃；进样量10 μL；样品运行程序：采用等度洗脱，缓冲液为体积比为49∶1 的流动相B 和A，样品运行时间19 min，在波长254 nm 处进行检测。

计算ATP 关联化合物的浓度计算公式：

式中，X表示凡纳滨对虾样品中的核苷酸及其关联化合物的含量(μmol/g)；C是六种核苷酸及其关联化合物的标准混合品浓度校准曲线（μg/mL）；V是样品提取物的体积（mL）；m是样品的质量（g）；M是每个核苷酸及其关联化合物的相对分子质量。

1.3.3K值、G值和P值的计算 根据Shahidi 的方法计算K值、G值、P值[3]。

式中，b为ATP 或其关联化合物的质量摩尔浓度（μmol/g）。

1.4 感官评定

采用Miao 等[13]方法并增加多种感官类别，用凡纳滨对虾感官评估的质量指标方法（Quality index method，QIM）评估对虾加热前后的感官质量（表1）。鲜度相同的凡纳滨对虾分为两部分，一部分保持生料，另一部分使虾肉中心温度达到75 ℃[14]。由6 名已通过味道/气味识别和基础味觉测试的成员分别进行感官评估。通过所有感官类别的QIM 得分，获得质量指标（Quality index，QI）值。QI 值为0，凡纳滨对虾质量最佳；QI 值增加，凡纳滨对虾品质变差。

表1 贮藏期间的凡纳滨对虾加热前后的感官质量评分Table 1 Sensory quality scores of Litopenaeus vannamei before and after heating during different storage periods

1.5 数据处理

每个样品平行处理3 次，数据处理和表格由WPS Office 2019 处理，结果以平均值±标准偏差表示。使用JMP 拟合分析（最小二乘均值差值Tukey HSD）进行显著性分析，P＜ 0.05 表示差异显著；图形处理由Origin2017 进行。

2 结果与讨论

2.1 六种ATP 关联化合物的高效液相色谱图

图1 可见，6 种ATP 关联化合物在30 min 内可有效分离，经单标和混标定性分析，峰保留时间在6.4 min 左右为IMP，7.6 min 左右为ATP，9.1 min左右为ADP，11.1 min 左右为HX，13.9 min 左右为AMP，25.9 min 左右为HXR。可见，该检测方法可节约时间和成本，重现性良好，流动相配置简便，采用等度洗脱充分保护柱子固定相；操作简便，效率高。

2.2 六种核苷酸及其关联化合物的标准曲线

如表2 所示，六种核苷酸标准品在2～ 125 μg/mL 时呈现良好的线性关系，R2均在0.999 5 以上，检出限（LOD）为0.06～ 0.12 μmol/L，定量限（LOQ）为0.26～ 0.38 μmol/L。方程中，y，峰面积；x，样品浓度。

图1 六种核苷酸相关化合物标准品的高效液相色谱Fig.1 HPLC analysis of six nucleotile-related compound standards

表2 六种核苷酸及其关联化合物的标准曲线Table 2 Standard curve of six ATP-related compounds

2.3 贮藏期内凡纳滨对虾加热过程中ATP 及其关联化合物的变化

由图2a 可见，凡纳滨对虾在4 ℃下贮藏时，随着贮藏时间的增加，ATP 含量降低；对虾中的ATP含量在贮藏期随着加热温度的上升呈现下降趋势。凡纳滨对虾生虾的 ATP 质量摩尔浓度为 0.30 μmol/g，当加热温度75 ℃时，ATP 质量摩尔浓度降至0.06 μmol/g，仅为生虾的20%。贮藏5 d 组的生虾ATP 消耗殆尽，当加热到40 ℃时，ATP 已检测不到；贮藏6～ 7 d 组，生虾ATP 已检测不到。虾类水产品中ATP 下降可能与体内高活性的ATP酶有关[15]。在加热过程中ATP 含量降低，可能由加热而引发的热降解所致。由于贮藏期不同，当加热到终点温度（75 ℃）时，ATP 降解率也不同：贮藏0～ 1 d 组ATP 降解80%左右，贮藏2～ 3 d 组降解65%左右，5～ 7 d 组降解100%。

图2b 可见，生虾在贮藏期间ADP 含量呈下降趋势，贮藏1 d 时降解较快，贮藏2～ 7 d 时ADP含量缓慢下降。生虾随着加热温度的增加，ADP 含量呈先增后降趋势。生虾加热到40 ℃，ADP 质量摩尔浓度为1.17 μmol/g，随着加热温度的升高，ADP 含量开始缓慢降低，在75 ℃时为0.47 μmol/g；贮藏1～ 5 d，加热至40 ℃时，ADP 含量变化无统计学意义（P＞ 0.05），至45～ 75 ℃时降低。贮藏6～ 7 d，随着加热温度升高，ADP 含量下降。可能与ATP 含量在贮藏6～ 7 d 时耗尽有关。生虾加热到75 ℃时ADP 降解51.13%，贮藏4 d，加热到75 ℃时ADP 降解39.13%，贮藏7 d 降解92.63%。贮藏期间的凡纳滨对虾加热前后ADP 的降解趋势与ATP 的变化趋势相似。

图2 贮藏时间对凡纳滨对虾加热过程中ATP 和ADP 含量的影响Fig.2 Changes of ATP and ADP contents in the heating process of Litopenaeus vannamei under different storage periods

图3 可见，凡纳滨对虾生虾随着贮藏时间的增加，AMP 含量不断降低，可能由AMP 脱氨酶分解所致[16]。凡纳滨对虾生虾中的AMP 含量在不同贮藏期加热过程中，随着加热温度的增加而增加，可能是由ATP 和ADP 的降解生成AMP，加之AMP酶在40 ℃以上时易失活，AMP 降解减少，同时水分含量降低，使AMP 含量上升。凡纳滨对虾生虾AMP 质量摩尔浓度为6.30 μmol/g，加热至75 ℃时升至9.51 μmol/g，是生虾的1.51 倍。生虾贮藏7 d后，仅为1.89 μmol/g，加热到75 ℃时，AMP 质量摩尔浓度为3.65 μmol/g。凡纳滨对虾加热到75 ℃时，不同贮藏时间组的AMP 增加：生虾和贮藏1～2 d，凡纳滨对虾加热到75℃时AMP 增加55%左右；贮藏3 d，AMP 增加91.90%；贮藏4～ 6 d，增加63%左右；贮藏7 d，增加92.89%。将刀额新对虾（Metapenaeus ensis）蒸至75 ℃时AMP 含量显著高于生虾[10]，与本研究结果一致。

图3 可见，凡纳滨对虾生虾的IMP 含量随着贮藏时间的增加呈先增后降趋势。贮藏1～ 5 d，IMP随着加热温度的增加呈先增后降趋势；贮藏6～ 7 d，随着加热温度的增加而降低，其原因可能是因为ATP 和ADP 在贮藏期间消耗完全和AMP 含量不断降低，导致IMP 含量降低。凡纳滨对虾生虾的IMP质量摩尔浓度为3.78 μmol/g，加热到40 ℃时为4.65 μmol/g，75℃时为2.01 μmol/g，从40 ℃至75 ℃，IMP 降解56.77%；贮藏2 d，IMP 质量摩尔浓度为4.92 μmol/g，加热到40℃时达到最大值，质量摩尔浓度为5.56 μmol/g，75 ℃时为2.8 μmol/g，从40 ℃至75 ℃，IMP 降解49.64%；生虾贮藏6 d，IMP质量摩尔浓度为2.44 μmol/g，加热到40 ℃时为2.34 μmol/g，75 ℃时为0.99 μmol/g（降解59.42%）；贮藏7 d，IMP 质量摩尔浓度为1.99 μmol/g，加热到40 ℃时为1.89 μmol/g，75 ℃时为0.82 μmol/g（降解58.79%）。

图3 贮藏时间对凡纳滨对虾加热过程中AMP 和IMP 含量的影响Fig.3 Changes of AMP and IMP in the heating process of Litopenaeus vannamei under different storage periods

图4 表明，凡纳滨对虾生虾的HXR 和HX 随着贮藏时间的增加而增加；不同贮藏期的凡纳滨对虾生虾中的HX 和HXR 在加热过程中总体上呈降低趋势，可能是将热降解的缘故。生虾的HXR和HX 分别为0.49、0.26 μmol/g，加热到40 ℃时分别为0.54、0.31 μmol/g，加热到75 ℃时分别为0.21、0.08 μmol/g；生虾在贮藏7 d 后分别达到1.57、1.79 μmol/g，加热到75 ℃时分别为1.21、1.00 μmol/g。生虾和贮藏1、2 d 的凡纳滨对虾加热到75 ℃时，HXR 和HX 降解50%左右，贮藏3～ 5 d 后降解25%左右，随贮藏时间的增加而降解速率降低。贠三月等[7]比较凡纳滨对虾生熟虾肉时发现，熟虾肉HXR 和HX 含量显著低于生虾肉，与本研究结果一致。

综上，ATP 关联化合物的变化与贮藏时间和加热温度密切联系，且贮藏时间直接影响加热过程中的ATP 关联化合物的降解规律；ATP 关联化合物的降解或生成率随着贮藏时间而变化；从呈味核苷酸角度分析，随着贮藏时间的增加，鲜味成分（IMP）先增后降，甜味成分（AMP）不断降低，苦味成分（HXR 和HX）呈不断增加趋势，随着加热温度的增加，鲜味成分先增后降，甜味成分呈增加趋势，苦味成分略有下降。

图4 贮藏时间对凡纳滨对虾加热过程中HXR 和HX 含量的影响Fig.4 Changes of HXR and HX contents in the heating process of Litopenaeus vannamei during different storage periods

2.4 贮藏时间对凡纳滨对虾加热前后感官品质的影响

表3 可见，随着贮藏时间的增加，凡纳滨对虾加热前后的QI 值均显著增加（P＜ 0.05），说明随贮藏时间的增加，生虾鲜度降低，加热后感官质量下降。生虾气味和颜色在贮藏期有显著性变化（P＜0.05），不论生虾还是加热后，感官指标在贮藏2 d时均发生显著性变化（P＜ 0.05）。贮藏3 d 时，生虾出现腥味和异腥味的痕迹，颜色已显暗黑色。在贮藏4～ 7 d 后，变质严重，气味更加难以接受。生虾在3 d 不可接受，但加热过后，勉强可接受。但贮藏4～ 7 d 再加热的虾，感官不可接受。通过对感官质量评定，生虾在贮藏2 d 时QI 值为6.63，达到感官质量的最大可接受限值，贮藏3 d 再加热QI 值为9.79，达到感官质量的最大可接受限值，表明贮藏期间凡纳滨对虾加热后的质量与生虾鲜度密切相关。

表3 用QIM 对贮藏期凡纳滨对虾的感官评定Table 3 Sensory evaluation of Litopenaeus vannamei in different storage periods by QIM

表3 续（Continued）

2.5 不同贮藏时间凡纳滨对虾加热前后K 值、G 值和P 值的变化

如图5 所示，随着贮藏时间的增加，生虾的K值呈线性增加趋势，说明凡纳滨对虾的鲜度不断降低。加热后凡纳滨对虾K值也呈线性增加趋势，加热后凡纳滨对虾的K值低于生虾。生虾和加热后虾，在贮藏0 d 时K值分别为6.19%、2.35%，贮藏2 d时K值分别为11.62%、7.26%，贮藏4 d 时分别为20.28%、15.97%，贮藏7 d 时分别为45.84%、33.02%。从呈味角度看不同贮藏时间对虾加热后的K值：K值上升，说明随着贮藏时间的增加苦味物质占ATP 关联化合物总量比例增加；而加热后的K值低于生虾，说明加热使生虾中的苦味物质减少，从而苦味物质占ATP 关联化合物总量比例减少。根据感官质量分析，贮藏2 d 的QI 值为生虾的最大可接受限值，贮藏3～ 4 d 的QI 值为加热后对虾的最大可接受限值，因此，生虾和加热后的虾K值最大可接受上限分别为11.62%和11.87%。

图5 可见，生虾K值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.934 6，加热后对虾K值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.962 1，表明生虾和加热后对虾的贮藏时间与K值具有较好相关性，K分别可评估生虾的鲜度和加热后虾的品质，当凡纳滨对虾鲜度下降时，烹饪后对虾的质量也降低。贮藏期间的K值与生熟鱼虾品质密切关联。Takashi 等[17]分析生鱼肉与蒸煮鱼肉K值的线性回归值时，发现蒸干鱼制品K值反映了原材料的鲜度和品质。戚晓玉等[18]研究表明，日本沼虾（Macrobranchium nipponense）在贮藏期间K值的变化趋势与TVB-N的变化趋势基本相似，K值变化与贮藏时间有较高的线性关系，K值作为日本沼虾鲜度的指标较TVB-N 更为合适。可见，K值可作为评估对虾鲜度的指标。

图5 贮藏期内凡纳滨对虾加热前后K 值的变化Fig.5 Changes of K value before and after heating of Litopenaeus vannamei under different storage periods

由图6 可知，随着贮藏时间的增加，凡纳滨对虾生虾的G值呈线性增长趋势，加热后对虾的G值也呈线性增长趋势。加热后对虾的G值低于生虾。生虾和加热后对虾G值分别为7.09%、2.48%，贮藏7 d 时分别为59.38%、39.04%。从呈味角度看，加热后对虾苦味物质（HX 和HXR）的减少和甜味物质（AMP）增加，造成加热后G值低于生虾。由于贮藏时间增加，苦味物质增加，造成加热后对虾G值的增加。贮藏2 d 时QI 值为生虾感官最大可接受限值，贮藏3～ 4 d 时QI 值为加热后对虾的感官最大可接受限值，生虾和加热后对虾的G值最大可接受上限分别为12.69%和12.84%。

生虾的G值与贮藏时间的线性回归方程的决定系数为0.875 9，相关系数较低，不适合作为凡纳滨对虾生虾的鲜度指标。Mohan 等[19]研究发现，鱼肉的鲜度指标G值与贮藏时间的线性回归方程决定系数低于0.90，不适合作为鲜度指标，与本文结果一致。但加热后对虾的G值和贮藏时间线性回归方程的决定系数为0.953 5，相关性较佳，可作为评估虾肉鲜度的指标。

图6 贮藏期内凡纳滨对虾加热前后G 值的变化Fig.6 Changes of G value of Litopenaeus vannamei before and after heating in different storage periods

由图7 可知，随着贮藏时间的增加，凡纳滨对虾生虾P值呈线性增长趋势，加热后对虾P值也呈线性增长趋势。加热后对虾P值低于生虾。生虾和加热后对虾贮藏0 d 时P值分别为6.92%、2.46%，7 d 时分别为46.46%、33.18%。从呈味角度看，加热后对虾P值是苦味物质与呈味物质的比值。加热后对虾苦味物质减少，甜味物质增加，造成加热后对虾P值低于生虾。由于贮藏时间的增加，苦味物质也不断增加，造成加热后P值增加。贮藏2 d 时QI 值为生虾的最大可接受限值，贮藏3～ 4 d 时加热后对虾QI 值为最大可接受限值，生虾和加热后对虾P值最大可接受上限分别为12.02%和12.09%。

生虾P值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.924 4，加热后对虾P值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.976 4，相关性均较佳，P值分别可评估生虾鲜度和加热后对虾的品质。

随着贮藏时间的增加，生虾的K值、G值和P值呈线性增长趋势，导致加热后对虾的K值、G值和P值也呈线性增长趋势，这在鲈鱼（Lateolabraxjaponicus）[20]、欧洲鳗鱼（European eel）[21]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[22]亦有类似结果。当表征生虾鲜度的K值、P值增加时，生虾鲜度降低，从而导致烹饪后的虾的品质下降。这可能主要归因于IMP 的快速减少和HX 的增加。

图7 贮藏期内凡纳滨对虾加热前后P 值的变化Fig.7 Changes of P value of Litopenaeus vannamei before and after heating in different storage periods

2.6 QI 值与K 值、G 值和P 值的线性回归关系

由图8 可知，随着生虾感官质量评分QI 值的增加，生虾的K值、G值和P值也呈上升趋势；其与QI 值分别呈直线关系，线性回归方程的决定系数分别为0.934 6、0.876 0、0.924 4。其中G值的线性回归方程的决定系数较低，不适于表征生虾的感官质量。K值和P值可用来评估生虾的感官质量。

由图8 可知，加热后对虾K值、G值、P值随感官质量评分QI值的增加而增加。加热后对虾K值、G值和P值与QI 值的线性回归方程决定系数分别为0.921 0、0.907 5、0.944 8，因此，加热后凡纳滨对虾的K值、G值和P值可用来评估其感官质量。

图8 生虾及加热后凡纳滨对虾K 值、G 值和P 值与QI 值的相关性分析Fig.8 Correlation analysis of K value,G value and P value with QI value in different storage periods of raw and heated Litopenaeus vannamei

3 结论

本研究表明，随着贮藏时间的增加，ATP、ADP和AMP 下降；IMP 先上升后下降；HX 和HXR 上升。随着加热温度的增加，ATP 和ADP 下降，AMP增长，IMP、HX 和HXR 先增加后降低；ATP 关联化合物的变化与贮藏时间和加热温度密切联系，且贮藏时间直接影响凡纳滨对虾生虾加热过程中ATP关联化合物的降解规律；ATP 关联化合物的降解或生成随着贮藏时间而变化。生虾贮藏2 d 时达到最大可接受上限，贮藏3 d 时加热对虾达到最大可接受上限。G值不适宜作为生虾鲜度指标，K值和P值可评估生虾的鲜度，K值、G值、P值可评估加热后对虾的品质，当生虾鲜度降低时，烹饪后的纳滨对虾品质也随之降低。K值、P值可用来表征贮藏期生虾的感官质量；K值、G值、P值可表征贮藏虾加热后的感官质量。