不同类型丝状真菌发酵产酶性能比较及其混菌发酵性能研究

邓加聪 郭伟灵 周文斌 洪家丽 李 路 刘绘鹏 刘 斌 陈绍军 倪 莉 饶平凡 吕旭聪 *

（1 福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院 食品与发酵工业研究所 福建福清 350300

2 福州大学生物科学与工程学院 食品科学技术研究所 福州 350108

3 福建农林大学 国家菌草工程技术研究中心 福州 350002

4 福建农林大学食品科学学院 福州 350002）

黄酒在世界酿造史上独树一帜，与啤酒、葡萄酒并称为世界三大古酒，是中华民族的文化瑰宝，有着五千多年的悠久历史，享有“国酒”之美誉。黄酒发酵是以谷物为主要原料，添加富含微生物的酒曲进行生物转化的过程[1]。酒曲微生物主导的代谢活动是决定黄酒品质的重要因素[2]。酒曲中微生物在酿造过程中的相互作用及其代谢产物，使发酵体系中各种物质形态不断演变，最终形成黄酒味醇、香浓等特征[3]。我国黄酒酿造用的酒曲中微生物复杂多样，并随酒曲种类、产地和制曲工艺的不同而存在差异，主要包括丝状真菌、酵母菌和细菌3大类。

丝状真菌在黄酒酿造中主要负责产液化酶和糖化酶，将淀粉转化为葡萄糖供酵母菌利用，进一步转化为乙醇等挥发性风味物质。此外，某些丝状真菌还能够产蛋白酶促进蛋白质水解转化为氨基酸，增加了醪液中可被根霉菌和酵母菌等微生物利用的有机氮源氨基酸，促进了根霉菌与酵母菌更健壮地生长，使醪液中的糖更多地转化为酒精，从而提高原料出酒率[4]。纯种发酵摆脱了多种微生物共存的相互作用，可对单一目的菌株形态结构、生理生化和遗传特性进行研究。然而，长期的试验和生产中发现纯种菌株在发酵过程中难以完成或微弱进行一些生化过程。单一菌种发酵难以克服发酵中间产物对发酵产物造成的不利影响，导致其营养价值和风味不及混菌发酵产品[5]。

混菌发酵是指采用两种及以上菌株进行混合发酵，其可利用微生物之间酶系的协同作用，有效提高酶活力，提高原料的利用率，降低其生产成本，同时使其产品具有浓郁的酒香味道。方华等[6]研究发现真菌混合培养时的酶系远复杂于单一真菌培养产酶之和，在混合培养体系中产酶种类或酶活力较单一真菌培养变化显著，尤其是米曲霉和黑曲霉混合培养时能显著提高蛋白酶活力。本文首先将实验室前期从福建红曲黄酒酿造用曲中分离的4种丝状真菌（黑曲霉、黄曲霉、米曲霉和米根霉）与台湾生物资源研究及保存中心（BCRC）购买的菌株进行产酶性能比较，从中筛选出产液化酶、糖化酶和蛋白酶活力较高的菌株；其次，进行单一菌株和两两混菌糯米试饭发酵，研究其产酶及产糖性能，为黄酒传统酿造工艺的改进和优良产酶菌株的筛选提供重要的基础数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与培养基

吐温 80、可溶性淀粉、乙酸、乙酸钠、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、磷酸（H3PO4）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸、碘、碘化钾、福林酚试剂（Folin试剂）、碳酸钠、三氯乙酸（TCA）均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司；麸皮和糯米，福州台江农贸市场。

麸皮培养基：麸皮∶水＝1∶1（质量比）；自然pH，121℃灭菌20min。

糯米培养基 ：糯米∶水=30∶36（质量比）；自然pH，100℃灭菌60min。

1.2 菌株及其编号

表1 菌株及其编号Table1 Strains and their numbers

1.3 仪器与设备

电子天平TE601-L，德国赛多利斯公司；电热鼓风干燥箱DHG-9123A，上海精宏实验设备有限公司；超净台SW-CJ-IFD，上海博讯实业有限公司；手提式压力蒸汽灭菌锅YXOSG41280，上海医用核子仪器厂；隔水式恒温培养箱GNP-9080，上海精宏实验设备有限公司；普通光学显微镜XSB-3，上海光学仪器厂；数显恒温水浴锅HH-6，上海申滕上午技术有限公司；可见分光光度计UV-1600，上海美谱达仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 不同类型丝状真菌发酵产酶性能比较 以麸皮培养基为发酵培养基，进行单一丝状真菌菌株（黑曲霉AN19、黄曲霉AF20、米曲霉AO35、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494、黄曲霉BCRC31654、米曲霉BCRC30222和米根霉BCRC32229）发酵（接种量：106个孢子/g 糯米），在30℃下培养72 h，通过测定发酵产物的酶活力（糖化酶、液化酶、蛋白酶），从中筛选出产酶能力较高的丝状真菌菌株。

1.4.2 不同类型丝状真菌纯菌和混菌试饭发酵 以糯米培养基为发酵培养基进行纯菌（接种量：106个孢子/g糯米）和两两混菌（接种量：每种菌0.5×106个孢子/g糯米）的糯米试饭发酵动力学试验，测定发酵过程酶活力（糖化酶、液化酶、蛋白酶）和还原糖的变化情况。

1.4.3 理化指标的测定

1）糖化酶活力测定 取两根试管A、B，分别加入0.1mL适量稀释的酶液，然后加入0.5mL的2%可溶性淀粉乙酸乙酸钠溶液，在40℃准确反应10min，立即加入0.4mL DNS试剂，在沸水浴中准确煮沸5min，用水冷却，最后定容至5.0mL，在波长540 nm处测定吸光度[7]。

一个酶活单位的定义：在上述条件下每小时生成1 mg葡萄糖所需的酶量。酶活计算公式：

酶活力（U/g曲）=10×6×Y×D×a（1）

式中，10——0.1mL稀释酶液换算成1mL；6——10min换算成1 h；Y——平均吸光度对应于标准曲线的纵坐标值；D——稀释倍数；a——为浸提液酶活和曲酶活的换算系数。

2）液化酶活力测定 取3根试管加入适当稀释的酶液0.1mL，然后加入1mL 0.5%可溶性淀粉磷酸溶液，在40℃准确反应10mim后，用1 mL 0.1mol/L H2SO4终止反应，取0.1mL反应液与 1mL 碘液（0.4mmol/L I2-KI）显色，在 620 nm波长处测吸光度。以0.1mL水代替0.1mL反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的pH 6.0磷酸缓冲液）的管为对照。空白1根试管，对照1根试管[7]。在上述条件下水解1mg淀粉的酶量定义为一个活力单位。酶活力计算公式：

酶活力（U/g曲）=[（A0-A）×50×D/A0]×b（2）

式中，A0，A——对照和反应液的光密度；D——酶的稀释倍数；b——浸提液酶活和曲酶活的换算系数。

3）蛋白酶活力测定 取2根试管，每管内加入稀释酶液1mL，置于40℃水浴中预热2min，加入经同样预热的酪蛋白1mL，精确保温10min后立即再各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心，另取2根试管，每管加入滤液1mL，再加0.4mol/L碳酸钠5mL和已稀释的福林试剂1 mL，摇匀，40℃保温发色20min后在660 nm波长下进行光密度（OD）测定。空白试验也取试管两根，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位[8]。

样品蛋白酶活力（U/g曲）=4×A×N×c/10（3）

式中，A——由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸质量（μg）；4——4mL反应液取出1mL测定（即4倍）；N——酶液稀释的倍数；10——反应10min；c——为浸提液酶活和曲酶活的换算系数。

4）还原糖含量测定 取2根试管A、B，分别加入0.1mL适量稀释的酶液，再加入0.4mL DNS试剂，在沸水浴中准确煮沸5min，用水冷却，最后定容至5.0mL，在540 nm波长处测定吸光度。空白组：取1根试管C，加入0.1mL蒸馏水，然后加入0.4mL DNS试剂，然后在沸水浴中准确煮沸5 min，用水冷却，最后定容至5.0mL，在540 nm波长处测定吸光度值[8]。

2 结果与分析

2.1 高产液化酶、糖化酶及蛋白酶丝状真菌菌种的筛选

成品曲在酿造过程产糖化酶、液化酶和蛋白酶活力是衡量酒曲质量的重要指标之一，直接影响黄酒的品质[9]。研究表明，较高的糖化酶、液化酶和蛋白酶活力，在发酵时可有效提高原料转化率，从而获得较高产酒率[7]；糖化酶是红曲霉的重要初级代谢产物之一，主要由于其能有效降解淀粉中α-1，4-糖苷键、α-1，6-糖苷键和α-1，3-糖苷键连接的碳链使其充分水解并转化为葡萄糖，进一步提高产酒率[10]；液化酶又称α-淀粉酶可任意水解淀粉分子链内的α-1，4-葡萄糖苷键产生小分子糖类，才能被酵母利用进行发酵[11]。蛋白酶可破坏原料颗粒间质细胞壁的结构，促进原料碳氢化合物暴露，提高其利用率，进而促进酒精发酵，且由于蛋白酶水解作用，提高了发酵料中氨基态氮的含量，进一步提高其产酒率[12]。目前，为保证成品曲的糖化酶、液化酶和蛋白酶活力，通常采用麸皮培养基培养米曲霉、米根霉等丝状真菌，将其按一定的比例混合进行酒曲制作。本研究以实验室前期分离菌株和购于台湾地区的菌株为研究对象，经发酵3 d测定其产糖化酶、液化酶和蛋白酶活力，结果如图1。

由图1可知，在产糖化酶、液化酶和蛋白酶方面，本实验室筛选的黄曲霉AF20都表现出较强能力，尤其在产糖化酶和液化酶都比其它菌株强。在糖化酶方面，本实验室筛选得到黄曲霉AF20和米根霉RO45都比来自台湾地区的菌株强，在固态麸皮培养基上发酵3 d后糖化酶活力分别为（3 880.75±33.15） U/g和（2 644.66±99.46） U/g，液化酶活力分别为（3897.48±105.17）U/g和（3453.14±126.41）U/g。本实验室筛选的黑曲霉AN19和米曲霉AO35在产糖化酶和液化酶都比来自台湾地区的菌株弱，在固态麸皮培养基上发酵3 d产糖化酶活力分别为（224.40±5.73）U/g和（971.66±138.64）U/g，液化酶活力分别为（452.23±33.05） U/g和（2 433.67±36.1）U/g。然而，相对黑曲霉AN19和米曲霉AO35，黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222表现出较强产糖化酶和液化酶能力。实验室筛选的黄曲霉AF20和米根霉RO45产蛋白酶较来自台湾地区的菌株相对较弱，黄曲霉AF20和米根霉RO45在固态麸皮培养基上发酵3 d，其蛋白酶活力分别为（460.55±21.24）U/g和（62.92±17.54）U/g。综合考虑各类型丝状真菌产糖化酶、液化酶和蛋白酶能力，最终选择筛选出黄曲霉AF20、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222菌株进一步做纯菌和混菌的发酵动力学试验。

图1 不同类型丝状真菌发酵对酶活力的影响Fig.1 Effects of different types of filamentous fungi on fermentation on enzyme activity

2.2 4株优良菌株单一菌株糯米试饭发酵产糖和产酶性能研究

对所选出4种类型丝状真菌（黄曲霉AF20、米根霉RO45、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）进行了糯米试饭试验，动态跟踪发酵过程还原糖含量和液化酶活力，结果如图2。

在酿造过程中，原料中淀粉可降解成还原糖、醇类和酯类等有机物的数量直接影响酒的营养价值和风味，其中还原糖作为酵母发酵重要底物，其含量直接影响产酒率[13-14]。由图2可知，接种纯种米根霉RO45的培养基中还原糖含量先升高后降低，最终含量比其它3种丝状真菌（黄曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）高，其它3种丝状真菌（黄曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）培养基中还原糖含量无明显差异。接种纯种米根霉RO45在发酵的第3天，还原糖含量逐渐降低，可能由于米根霉利用培养基中还原糖进行自身生长繁殖，导致其含量降低。

液化酶主要由酿造过程微生物产生，对发酵原料进行分解，液化酶活力大小直接影响原料利用率[14]。由图2可知，除黄曲霉AF20和米曲霉BCRC30222，其它2种丝状真菌（米根霉RO45和黑曲霉BCRC31494）液化酶活力呈逐渐增加的趋势。原因在于发酵初期，液化酶数量是影响其活力的主要限制条件，随着发酵时间的延长，发酵培养基的营养成为限制液化酶活力的主要因素。黄曲霉AF20和米曲霉BCRC30222在发酵第5天时，液化酶活力有所下降，之后又有显著上升趋势。酿酒过程中，酒醅中淀粉被降解为还原糖、醇类、酯类等有机物，其降解率是评价酒的营养价值、风味和品质还原糖含量是一个重要指标[15-16]。由图2可知，除实验室筛选的米根霉RO45外，其它3种丝状真菌（黄曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）随发酵时间的延长，还原糖含量逐渐增加，这主要由于发酵原料被降解转化为还原糖，并在发酵液中逐渐积累。综合考虑，接种米根霉RO45的培养基中还原糖含量高，而液化酶活力较强。

图2 4株优良菌株单一菌株糯米试饭发酵过程中还原糖含量和液化酶活力的变化Fig.2 The changes of sugar content and amylase activity for the brew tests with glutinous rice of four types of filamentous fungi

2.3 4株优良菌株两两混菌糯米试饭发酵对产酶性能和还原糖的影响

混合菌种发酵相对单一菌种发酵具有较强的发酵能力，发酵过程较为平稳，稳定期长等特点，并可降低酒中尖酸、刺激和苦涩等不良风味[17]。本试验选取4种类型丝状真菌（米根霉RO45、黄曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）两两混合进行糯米试饭试验，检测其液化酶活力，结果如表2。

从传统酒曲中分离丝状真菌进行鉴定，发现根霉种类数量仅次于曲霉[18]。由表2可知，米根霉RO45分别与黄曲霉AF20和米曲霉BCRC30222混合，都具有提高液化酶活力的作用，而与黑曲霉BCRC31494混合发酵7 d时，不如接种纯菌株产生液化酶活力强。接种来自台湾地区的米曲霉BCRC30222在任何发酵时间，除了与米根霉RO45混合发酵具有提高液化酶活力的作用以外，其它液化酶活力都低于接种单一丝状真菌，可能由于米曲霉能降解辅料中的粗纤维，使其淀粉充分暴露，被米根霉进一步水解，提高其液化酶活力。

黄曲霉广泛用于制曲酿酒，可产生大量液化酶和蛋白酶，从酿造开始到糖化，分解蛋白等作用，有助于缩短酿造周期[19]。检测黄曲霉在发酵第7天液化酶活力为1 000.163U/g，其分别与米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494混合培养，都导致其液化酶活力低于两种中任何一种丝状真菌。

由表3可知，接种纯种米根霉RO45在发酵第3天还原糖含量达到最大值，随着发酵时间的延长，还原糖含量降低且下降速度快。可能因为米根霉RO45自身生长繁殖消耗还原糖，使其还原糖含量下降。米根霉RO45与其它3种丝状真菌混合发酵，发酵过程中还原糖含量波动较小，在发酵3 d后还原糖含量变化较小。结果表明，相对混合丝状真菌发酵，纯种米根霉具有糖化能力强，周期短等优点[20]。丝状真菌两两混合发酵，米根霉RO45和米曲霉BCRC30222混合发酵产生还原糖能力高于其它两两丝状真菌混合发酵产还原糖能力，且远大于接种纯种米曲霉产还原糖含量。

表2 不同类型丝状真菌纯菌、混菌发酵对产液化酶性能的影响Table2 Effects of pure and mixed fermentation of different types of filamentous fungi on liquefaction enzyme properties

表3 不同类型丝状真菌纯菌、混菌发酵对还原糖产量的影响Table3 Effects of pure and mixed fermentation of different filamentous fungi on reducing sugar production

酒曲品质影响黄酒品质，而蛋白酶活力是评价酒曲品质的重要指标之一。蛋白酶可催化蛋白质中肽键断裂，具有效率高，条件温和，有效保留蛋白质的营养价值等优点。由表4可知，米根霉RO45与米曲霉BCRC30222混合发酵第7天有效提高蛋白酶活力至70.180U/g，克服了米根霉纯种发酵产蛋白酶不足的缺点，并改变了米曲霉在发酵第5天蛋白酶活力下降的趋势。可能因为米曲霉在发酵第5天，某中产物积累到一定量反而抑制其蛋白酶活力，而添加米根霉，可以延缓或抑制此现象的出现。

表4 不同类型丝状真菌纯菌、混菌发酵对产蛋白酶性能的影响Table4 Effects of pure and mixed fermentation of different types of filamentous fungi on protease properties

3 结论

1）比较实验室前期从福建红曲黄酒酿造用曲中分离的和台湾生物资源研究及保存中心（BCRC）购买的不同丝状真菌菌株（黑曲霉AN19、黄曲霉AF20、米曲霉AO35、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494、黄曲霉BCRC31654、米曲霉BCRC30222和米根霉BCRC32229）的产糖化酶活力、液化酶活力和蛋白酶活力。黄曲霉AF20和米根霉RO45均具有较强的产液化酶和糖化酶的活力，其中黄曲霉AF20还具有较高的产蛋白酶活力。黑曲霉BCRC31494和米根霉BCRC32229具有较高产液化酶、糖化酶和蛋白酶活力。综合各种因素，筛选出产酶活力较高的4株不同类型丝状真菌菌株：黄曲霉AF20、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222。

2）将筛选出的4株不同类型优良菌株（黄曲霉AF20、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222）进行糯米试饭发酵产糖和产酶性能的研究，发现接种纯种米根霉RO45还原糖产量最高，而蛋白酶活力较低。进一步将4种丝状真菌进行两两混合，测定其液化酶、蛋白酶活力和产还原糖性能，发现米根霉RO45与米曲霉BCRC30222、米根霉RO45与黄曲霉AF20两两混合发酵能够显著提高液化酶活力，其中米根霉RO45与米曲霉BCRC30222混合发酵不仅保持较高的液化酶活力和还原糖产量，还能够显著提升发酵体系中的蛋白酶活力。