嵌合抗原受体基因修饰的T细胞治疗实体瘤研究进展①

石崇灯 胡 渊 张 彩

(山东大学药学院免疫药物学研究所，济南 250012)

治疗癌症的工程化T细胞的出现标志着医学新时代的开始，为癌症等复杂疾病提供了一种全新的治疗方式。目前最受关注的治疗方法之一是在T细胞中引入嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)以产生具有超强抗肿瘤活性的CAR-T细胞。自2010年以来，许多临床试验已证明CAR-T细胞用于血液系统肿瘤具有良好的临床反应，其中急性B淋巴细胞白血病的缓解率高达70%～90%[1]。由于其令人振奋的治疗效果，诺华公司的Tisagenlecleucel(KYMRIAH)于2017年8月被美国FDA批准用于复发性或难治性急性B淋巴细胞白血病，并于2018年5月被批准用于弥散性大B细胞淋巴瘤[2]。

对血液肿瘤治疗的成功使得越来越多的研究者将目光集中在CAR-T细胞对实体瘤治疗的研究上，但收效甚微。Kershaw等[3]测试了靶向表达α-叶酸受体的卵巢癌细胞的CAR-T细胞的功效(NCT00019136)，在所有的14例患者中都没有观察到临床反应。在一些治疗实体瘤的临床试验中，CAR-T细胞治疗甚至显示出严重的肿瘤外靶向毒副作用。在一项靶向人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor,HER2)治疗转移性结直肠癌的临床研究中，1例患者在接受高剂量CAR-T细胞治疗5 d内死亡，导致该研究被迫终止。这可能是由于大量CAR-T细胞聚集至肺部，识别正常肺上皮细胞表达的低水平HER2而释放大量炎症细胞因子引起级联细胞因子风暴，导致急性肺损伤、低血压及多器官缺血和衰竭[4]。由于类似的原因，一项靶向癌胚抗原相关的细胞黏附分子5(CEACAM5)的CAR-T细胞治疗胃肠道肿瘤的试验也被终止[5]。本综述讨论与总结了最新的CAR-T细胞治疗实体瘤的研究进展，包括肿瘤特异性抗原的选择、增强免疫细胞向肿瘤迁移、克服肿瘤免疫抑制微环境及与免疫检查点抑制剂联用等新策略以增强CAR-T细胞对实体瘤的疗效，希望对临床前与临床CAR-T细胞治疗实体瘤研究提供新的思路与方向。

1 CAR-T细胞治疗实体瘤效果不佳的原因

CAR-T细胞治疗急性B细胞淋巴瘤取得出人意料的疗效的原因之一是CD19抗原选择的合理性。针对急性B细胞淋巴瘤，CD19是一个近乎完美的抗原。它几乎在所有的B细胞淋巴瘤细胞上高表达，除B细胞谱系外，在其它组织或细胞上均没有表达。其次，B细胞淋巴瘤是一种血液系统肿瘤，肿瘤细胞会在外周血与淋巴系统中循环，这有利于CAR-T细胞与肿瘤细胞相遇，进而消灭肿瘤细胞。

相对于血液瘤，实体瘤的组织微环境特点限制了CAR-T细胞的疗效。首先，实体瘤肿瘤细胞的异质性更加复杂，特异性高与安全性好的靶点选择更加困难。按照肿瘤抗原的特异性，可将肿瘤抗原分为肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigens,TSA)和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens,TAA)。TSA指仅表达于肿瘤细胞而不存在于正常细胞的抗原。TAA是指非肿瘤细胞所特有，在正常细胞上也有微量表达，只是在细胞发生癌变时表达量明显增加的一类抗原。实际上，大多数正在进行的针对实体瘤CAR-T细胞疗法临床试验都针对这样的TAA，包括间皮素(mesothelin,MSLN)、HER2、癌胚抗原、白细胞介素-13受体亚基α-2( IL-13 Receptor alpha 2,IL-13Rα2)、前列腺特异膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)和前列腺干细胞抗原等[6,7]。因此CAR-T细胞在实体瘤的临床治疗中可能出现明显的脱靶效应。并且，经CAR-T细胞治疗后，实体肿瘤由于压力选择而使抗原表达转阴，从而逃逸CAR-T细胞的特异性识别[8,9]。将靶向HER2的CAR-T细胞与胶质母细胞瘤细胞系U373共培养的实验证实了这一现象，起初U373细胞只表达HER2的比例为18%，只表达IL-13Rα2抗原的比例为16%，两种抗原均表达的比例为52%，约有14%的细胞这两种抗原均不表达。抗HER2-CAR-T细胞与U373细胞共培养至14 d时，98%的U373细胞只表达IL-13Rα2而未检测到HER2的表达[10]。

肿瘤周围存在许多屏障组织，并缺乏趋化因子分泌，这使得CAR-T细胞难以浸润至肿瘤内部。实体瘤的一个特点是基质细胞中含有大量的肿瘤相关成纤维细胞。这些细胞通过分泌胶原蛋白，形成致密的肿瘤组织，导致肿瘤内间质压的异常升高，成为阻挡CAR-T细胞浸润的物理屏障。异常的归巢分子表达和肿瘤血管系统也使T细胞难以渗入肿瘤组织并发挥其效应功能[11,12]。

即使有部分CAR-T细胞到达肿瘤内，它们也将面临抑制性肿瘤微环境的挑战。肿瘤细胞通过产生和分泌IL-1、IL-6、IL-10、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和前列腺素E2等细胞因子来塑造肿瘤微环境，这些细胞因子可通过募集免疫抑制性细胞直接或间接抑制T细胞功能[13]。由于缺氧、低营养成分及高浓度代谢酸的肿瘤组织微环境抑制T细胞正常代谢，导致T细胞无法增殖与分泌细胞因子[14]。肿瘤微环境高表达程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)等免疫抑制性受体(免疫卡控点)的配体，可与浸润的T细胞表面抑制性受体结合进而抑制T细胞功能。因此，CAR-T细胞在抑制性肿瘤微环境中功能往往被显著抑制[15]。

2 目前CAR-T细胞在治疗实体瘤的研究进展

2.1靶点选择 对实体瘤进行CAR-T细胞疗法的最大挑战是需要找到完美的靶抗原。甄选目标抗原需在安全性与有效性之间找到平衡点，以提供足够的CAR-T细胞活性并使毒副作用最小化。首先应该解决CAR-T在实体瘤治疗过程中因脱靶效应所引起的安全性问题。已有策略设计串联型 CAR，通过对同一细胞表达的两种肿瘤抗原的双重识别来确保靶抗原选择的特异性[16]，或设计抑制型CAR，识别肿瘤上不存在或下调但由脱靶组织表达的组织特异性靶抗原以避免对正常组织的损伤[17]。但这些策略不能从根本上改善CAR-T细胞的安全性，因此肿瘤特异性抗原靶点的寻找十分关键。

TSA的筛选主要是针对新抗原与肿瘤相关抗原表位转录后修饰突变的研究。非人类正常基因组来源的肿瘤新生抗原由基因组发生突变而产生，未经胸腺阴性筛选，与TCR亲和力高，免疫原性强，能诱发强有力的抗肿瘤免疫反应[18]。近几年多项临床研究结果均显示，肿瘤特异性新抗原是肿瘤浸润淋巴细胞、免疫卡控点阻断剂等发挥免疫治疗作用的主要靶点，且较高的肿瘤突变负荷与较好的临床免疫疗效密切相关，因此，新抗原被认为是包括CAR-T疗法的肿瘤免疫治疗十分理想的靶点[19,20]。表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)为人肿瘤中发现的最为常见的EGFR突变体，它源于自删除表达框2至7外显子外显子1和8连接处产生新的甘氨酸残基，而人体正常细胞不会表达EGFRvⅢ。对10名复发性胶质母细胞瘤患者进行靶向EGFRvⅢ 的CAR-T细胞治疗后，均未观察到脱靶效应或者细胞因子释放综合征[21]。但新抗原在不同个体之间存在巨大差异，因而鉴定一个能在不同个体之间通用的新抗原是十分困难的。

肿瘤相关抗原的表位受转录后修饰调控，例如糖基化与构象改变等。利用现有庞大的抗体库与蛋白质组学分析，寻找靶点抗原在肿瘤与正常组织上特定表位的差异，可特异性靶向该表位，使CAR-T细胞能区分肿瘤与正常组织。Hosen等[22]利用不同多发性骨髓瘤细胞系建立了超过10 000种杂交瘤抗体库。将不同抗体与病人来源的多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞或正常白细胞或非MM细胞染色，筛选出MMG49抗体只特异性结合MM。研究发现该单抗特异性识别活化性的整合素β7的N端区域，且该表位只在活化型构像时暴露，而静息时隐藏。基于MMG49抗体的CAR-T细胞不对正常细胞造成损伤，而是展现出良好的抗肿瘤效应。

2.2增强CAR-T细胞浸润至肿瘤组织内部的能力 肿瘤组织血管结构功能缺陷且富含细胞外基质，犹如坚实的壁垒使免疫细胞难以有效浸润[11,23]。 除此之外，肿瘤组织中黏附分子表达下调、趋化因子及其受体表达失调等因素也限制了免疫细胞在肿瘤组织中的聚集。

为增加CAR-T细胞向肿瘤的浸润，首先应突破肿瘤的物理屏障。已有许多研究通过设计靶向周围成纤维细胞、肿瘤血管系统及肿瘤基质的CAR-T细胞来突破肿瘤屏障[24-27]。设计表达趋化因子或趋化因子受体的CAR-T细胞可以促进其向肿瘤内部的浸润。例如，将趋化因子受体CCR2引入靶向MSLN和GD2的CAR-T细胞中，可明显增强T细胞的浸润并增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性[28,29]。

此外，有研究者从T细胞自身特性出发，寻找特定的高迁移性、高杀伤能力的T细胞亚群。研究发现人类CD26high的T细胞亚群具有更强的迁移能力、抗凋亡能力、细胞毒作用与干细胞特性，使得这群细胞更易向肿瘤内浸润，并具有更强的肿瘤内存活能力。这些特性使得CD26high的T细胞亚群有希望成为一群十分理想的针对实体瘤的CAR-T细胞来源[30]。转录因子Runx3能够编码促进CD8+T细胞在非淋巴组织和肿瘤中的驻留[31]。相比于引入某个单一的趋化因子受体，在CAR结构中引入关键调控转录因子能从根本上提高CAR-T细胞的迁移能力。

2.3针对肿瘤微环境 即使CAR-T细胞成功地迁移到肿瘤部位，肿瘤微环境的许多免疫抑制因素可能抑制其功能，甚至导致其发生功能耗竭。肿瘤微环境中抑制性细胞能够通过多种机制抑制免疫效应细胞活性，包括通过细胞与细胞间的接触抑制和抑制性因子的释放。肿瘤细胞通过产生和分泌各种抑制性细胞因子来塑造肿瘤微环境，这些细胞因子可以进一步募集免疫抑制性细胞到肿瘤部位，直接或间接抑制T细胞功能[13]。肿瘤微环境的免疫抑制是限制CAR-T疗效的一大挑战，研究人员已经研发了不同的策略来改善CAR-T细胞功能以克服对抗肿瘤微环境的免疫抑制。

肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，包括调节性T细胞(Treg)、髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)。为了克服抑制性免疫细胞的作用，已有研究设计同时靶向肿瘤细胞和免疫抑制性细胞的CAR-T细胞。Ruella等[32]发现CD123在TAM和霍奇金淋巴瘤细胞均有表达，靶向CD123的CAR-T细胞能够识别并杀伤TAM来克服肿瘤微环境的抑制，并发挥对肿瘤细胞的杀伤，并且在小鼠模型中还观察到了长期的免疫记忆。

为了消除肿瘤微环境中免疫抑制性细胞因子的抑制作用，Chmielewski等[33]将细胞因子基因插入到CAR结构中制备了能够产生特定细胞因子的TRUCKs(T cells redirected for universal cytokine killing)，其可在CAR介导的T细胞活化后释放特定的细胞因子。如分泌IL-12的CAR-T细胞可通过Fas-FasL相互作用清除高抑制性肿瘤相关巨噬细胞来逆转肿瘤微环境的抑制，并且可抵抗PD1-PD-L1信号传导轴的抑制。迄今为止，TRUCK设计中已采用了多种细胞因子，包括IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和TNFRSF14[34-38]。

另一方面，也有研究利用细胞因子信号通路的方式促进CAR-T细胞活化增殖。将白细胞介素-2受体β链的胞内段与CAR共刺激结构域CD28和胞内CD3z段连接，并将STAT3的结合基序YXXQ结合在CD3z C端，当CAR胞外段scFv与抗原识别后即可激活JAK-STAT3/5信号通路从而激活CAR-T细胞。因此，无需细胞因子作用，CAR-T细胞就可以获得类似的活化效应[39]。与TRUCKs相比，这种策略不分泌细胞因子，可避免因细胞因子持续过度释放而导致的细胞因子释放综合征及神经毒性等副作用。

值得注意的是肿瘤微环境中抑制性细胞因子占优势。例如，肿瘤内富含TGF-β，这是Treg分化和维持T细胞稳态的关键细胞因子[40]。有研究者针对此特点设计了能够阻断抑制性信号的受体分子。dnTGF-β受体是一种缺失TGF-β受体胞内信号段的TGF-β受体，当其与TGF-β结合后，由于缺乏胞内信号段而无法向下游传递信号，TGF-β信号被阻断。靶向PSMA的CAR与dnTGF-β 受体共表达的CAR-T细胞在高分泌TGF-β的前列腺癌动物模型中展示出了优异的抗肿瘤活性[41]。此外，有研究者将抑制性细胞因子受体的胞外段与活化性细胞因子受体的胞内段融合，将抑制性信号转化为活化性信号，以增强CAR-T细胞功效。研究者将IL-4受体的胞外段与IL-2或IL-7受体的胞内段嵌合，当其与肿瘤微环境中的IL-4结合后可产生模拟IL-2或IL-7受体的活性信号，将其与CAR共同装载在T细胞上，可将肿瘤IL-4介导的内抑制性信号转化为CAR-T细胞活化信号，从而抵抗肿瘤微环境的抑制[42,43]。

2.4CAR-T细胞治疗与其他方法联合使用

2.4.1与免疫卡控点阻断联合应用 克服免疫抑制并产生更强大的抗肿瘤免疫反应的一个有效策略是将CAR-T细胞和免疫卡控点的单克隆抗体联合应用。在临床前治疗模型中，抗PD1及抗CTLA-4单克隆抗体的联用可以阻断这些PD-1和CTLA-4介导的抑制作用，并增强CAR-T细胞的功能[44-46]。临床上已证实，与抗PD-1单克隆抗体联合使用的HER2-CAR-T细胞在乳腺癌和肉瘤的治疗中已显示出更强的增殖能力和抗肿瘤效应[46]。

2.4.2新型基因编辑工具 新型基因编辑工具丰富了CAR-T细胞策略，以改善其功能。例如，锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶和CRISPR/Cas9等基因编辑工具可用于敲除基因，也可以在精心设计的供体模板存在情况下将遗传信息敲入基因组中。Eyquem等[47]利用CRISPR/Cas9系统将CAR基因敲入T细胞受体α恒定基因座，这不仅使得T细胞表达统一的CAR分子，而且增强了CAR-T细胞的抗肿瘤能力，延缓了CAR-T细胞的分化与耗竭。有研究者利用基因组编辑技术敲除PD-1、CTLA-4和LAG-3等抑制性受体，来改善CAR-T细胞的抗肿瘤活性[48-50]。已证实，敲除PD-1的CAR-T细胞能明显抵抗来自PD-L1+肿瘤细胞的抑制，更有效地清除荷瘤小鼠的肿瘤[48]。

2.4.3溶瘤病毒 溶瘤病毒(oncolytic virus,OVs)通过感染癌细胞,引起病毒性细胞病变并诱发宿主抗肿瘤免疫反应，从而选择性感染和杀死癌细胞。目前，表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的溶瘤疱疹病毒已被FDA批准用于恶性黑素瘤的治疗[51]。通过对OV进行编程可以特异性地靶向、在癌细胞中复制和裂解癌细胞，而不影响正常细胞。OV在肿瘤细胞中复制和繁殖可直接导致肿瘤细胞的裂解，同时亦为唤醒免疫系统提供必需的危险信号[52]。通过对OV进基因修饰使之表达能够逆转肿瘤免疫抑制微环境、增强疗效的治疗性基因(如细胞因子、趋化因子、抗PD-L1微小抗体等)并可与CAR-T细胞疗法联合治疗。最近的一项研究证明，表达IL-2和TNF-α的溶瘤腺病毒能够增强靶向间皮素的CAR-T细胞对胰腺导管癌的疗效，这与增强T细胞浸润到肿瘤部位和减少肿瘤转移有关[53]。

3 展望

已经证明CAR-T细胞对血液肿瘤具有强大的治疗作用，但其对于实体瘤治疗的应用仍处于早期发展阶段，仍然有许多问题有待解决。T细胞作为一群异质性的细胞群，其中是否存在更合适的T细胞亚群作为CAR的宿主细胞？是否有更佳的CAR结构设计可以抵抗抑制性的肿瘤微环境？是否不同药物联合治疗、序贯治疗等方式能增强CAR-T细胞治疗的效果？随着这些问题的研究与解决，CAR-T细胞治疗实体瘤的进展将取得更大的突破。