角质形成细胞在银屑病中作用的研究进展①

黄海勇 黄功华 刘新光

(广东省医学分子诊断重点实验室,广东医科大学衰老研究所，广东医科大学生物化学与分子生物学研究所,东莞 523808)

银屑病是慢性易复发炎症性皮肤病,可分为寻常型、斑点型、间质型、脓胞型、红皮病型，临床症状为界限清楚的红色斑点、丘疹、皮肤褶皱、银白色样鳞屑，病理变化为角质形成细胞(keratinocyte,KC)高度异常增殖、角化不全、棘皮增厚、伴有炎症细胞浸润和血管增生，在世界范围内的患病率大约为2%[1-3]。银屑病由表皮和真皮中不同的效应白细胞亚群的浸润引起，涉及固有性和适应性免疫过程。关于KC在银屑病中的作用尚存争议，研究认为KC的过度增殖和异常分化是免疫系统激活诱导的次要现象，主要基于免疫功能紊乱的树突细胞(dendritic Cell,DC)和Th17细胞，而银屑病不能被认为是单独的DC和Th17细胞依赖性免疫疾病。健康的皮肤为机体提供有效的物理和免疫保护屏障，最先接触病原体而快速感知环境信号变化，并对不同的刺激信号产生反应，维持皮肤生理功能的动态平衡。KC在银屑病早期触发致病事件及维持疾病慢性期方面起重要作用,在触发因子(如皮肤创伤、病原体或药物等)激活后打破皮肤生理稳态，产生细胞因子(包括抗菌肽、IL-1家族和趋化因子等)成为先天免疫介质来源，皮肤免疫微环境改变并通过募集DC、中性粒细胞、Th17细胞和巨噬细胞等引发适应性免疫[4]。KC和适应性免疫细胞的相互作用进一步加剧炎症反应，并维持疾病慢性期。此外，由免疫细胞产生的细胞因子诱导的关键信号通路的激活和KC内在遗传信息改变，可能是造成增殖和分化过程不平衡及在银屑病皮肤中诱导炎症反应的原因。目前银屑病研究的模型主要包括自发性小鼠模型、基因动物模型、异体移植动物模型和人工诱导的动物模型[5]。尽管银屑病既往的研究取得了重大进展，但具体发病机制尚不明确。研究KC在银屑病的发病机制对临床治疗和预后、提高患者生活质量具有重大意义。

1 KC在银屑病中的屏障功能

1.1磷脂酶C同工酶PLCδ1(phospholipase C isozymes δ1,PLCδ1)异常破坏KC屏障完整性 磷脂酶C(phospholipase C,PLC)是磷脂酰肌醇信号通路的关键酶，活化的PLC能水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(Phosphatidylinositol biphosphate,PIP2)产生重要的第二信使二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)。IP3是细胞质Ca2+浓度梯度的主要调节因子。PLC调节细胞活动的生理途径，并调节和协调这些途径中的其他酶作用，控制细胞生理学行为[6]。研究发现，在银屑病的病损皮肤中PLC的同工酶活性PLCδ1下降[7]。在咪喹莫特(imiquimod,IMQ)诱导的银屑病模型中，敲除PLCδ1不但可影响KC的屏障功能，并且可破坏KC之间的紧密连接。体外研究证明，抑制PLCδ1表达后，内质网Ca2+通道的Ca2+释放不足导致细胞质内Ca2+浓度降低，Ca2+诱导的核转录因子(nuclear translocation of the transcription factor,NFAT)活化不足，使与屏障功能相关的下游基因转录表达水平下降。另外，PLCδ1被抑制后p38的磷酸化水平升高，从而抑制RhoA信号通路，在PLCδ1敲除的细胞中通过p38抑制剂抑制p38磷酸化活性，恢复丝聚蛋白(Filaggrin)和紧密连接蛋白1(zonula occludens-1 protein,ZO-1)水平。表明在银屑病病损皮肤中，PLCδ1表达降低导致p38磷酸化水平升高可损伤KC屏障功能[8]。

1.2CARD14激活NF-κB信号通路影响KC屏障功能 半胱天冬酶募集结构域封闭蛋白质(caspase recruitment domain-containing protein,CARD)是氨基酸序列极度保守的细胞支架蛋白，发挥关键生物学功能，包括免疫应答和炎症调节、组织稳态和G蛋白偶联受体信号传导的调节[9]。人CARD蛋白分别由位于7,17和22号染色体上3个保守基因编码。CARD家族的表达具有组织差异性，CARD14主要在KC中表达。CARD14：BCL10：MALT1(CBM)复合物是维持固有免疫和适应性免疫应答的重要信号节点，主要通过识别上游病原体相关模式分子(如KC上表达的TLR家族成员)激活发挥效应，发挥在表皮屏障的固有免疫防御作用[10，11]。细胞接受刺激后，位于卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)和突触前密度蛋白(post-synaptic density protein,PDZ)之间的抑制性接头区域的CARD14通过蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介导的丝氨酸残基的磷酸化去除抑制，从而促进CBM复合物形成，最终导致IκB激酶复合物(IκB kinase complex ,IKK)的募集和NF-κB活化[12，13]。CARD14通过募集BCL10和MALT1促进NF-κB和MAPK信号通路激活，从而上调编码IL-36γ、IL-8、CCL20和抗菌肽等促炎基因，刺激DC活化并分泌IL-23、IL-1β诱导naive T 细胞向Th17分化加剧炎症反应[14]。小鼠CARD14基因中第138位谷氨酸突变后可引起自发性银屑病，包括特征性的临床表现和病理变化，皮肤出现类似于银屑病的典型细胞因子、趋化因子和抗菌肽基因的上调及丝聚蛋白和连接蛋白表达下降[15]。因此，CARD14是银屑病的易感基因并对银屑病的预测和预后具有重要意义。

2 KC的增殖和分化

2.1视黄醇结合蛋白Ⅰ(cellular retinol binding protein Ⅰ,CRBPⅠ) 视黄醇(维生素A)及其代谢产物视黄醛和全反式维甲酸是细胞活动的天然调节剂，介导皮肤细胞调节功能[16]。视黄醇水溶性差，胞质内CRBPⅠ有助于细胞摄取视黄醇，保护视黄醇免受与酶的非特异性相互作用，将全反式维甲酸递送至核受体(CRABP2，FABP5)，维持全反式视甲酸在细胞内的功能稳定，调节细胞凋亡、增殖和分化进程[17]。银屑病患者的病损皮肤侧CRBPⅠ异常升高，IMQ诱导的小鼠银屑病模型中，CRBPⅠ基因敲除小鼠的发病程度比野生型小鼠更严重。在人表皮细胞中持续表达CRBPⅠ，维持细胞增殖NF-κB和AKT信号通路、显著激活，与视黄醇在细胞内过度累积导致细胞功能异常相关。炎症因子IL-2和IL-6诱导辅助性T细胞活化，并维持辅助性Th17细胞和调节性T细胞平衡，在人表皮细胞中过表达CRBPⅠ可明显降低IL-2和IL-6水平[18]。病损皮肤中高表达的CRBPⅠ同样能诱导早期生长反应基因1(early growth response gene 1，EGR1)表达[19]。KC中EGR1通过抑制细胞分裂周期基因25A(cell division cycle 25 A,CDC25A)表达和降低细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinas 2,CDK2)上的Tyr15/Thr14去磷酸化水平减少CDK2 /细胞周期蛋白E复合物激活，使细胞周期停滞在G1期，这可能是银屑病CRBPⅠ介导EGR1抑制细胞增殖的潜在机制[20]。

2.2Wnt5a/β-Catenin信号 Wnt5a参与KC增殖的整个过程，与正常皮肤相比，Wnt5a及其7 次跨膜蛋白卷曲受体Frizzled2/5在银屑病病损皮肤中高表达。同时，凋亡相关蛋白Caspase-3降低而抗凋亡相关的Bcl-2、生存素相应升高。研究发现，Wnt5a可通过经典的Wnt/β-catenin途径或非经典的PKC/钙依赖性蛋白激酶Ⅱ途径影响KC增殖凋亡，胞质中的β-catenin在GSK3β/Axin/APC蛋白复合物作用下无活性[21]。Wnt5a信号激活使复合物中的GSK3β磷酸化水平升高，对β-catenin的抑制能力下降，导致β-catenin转位到细胞核调节下游Cyclin D1、C-myc活性，调节KC增殖。敲除Wnt5a可下调细胞增殖相关的标志如PCNA和KI67的水平。同时，病损皮肤中的IL-36γ借助Wnt/β-catenin信号抑制KC分化并诱发炎症反应[22]。

2.3PI3K/AKT/mTOR信号通路 银屑病患者中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)水平升高，多种炎症因子如IL-6、IL-12、CXCL8、VEGF可被mTOR信号通路激活分泌[23]。PI3K/AKT/mTOR信号通路是真核细胞的关键信号点，调节细胞生长、增殖和新陈代谢。银屑病中，KC在细胞外信号作用下，PI3K在配体结合酪氨酸激酶受体或G蛋白偶联受体后活化，PI3K与胞膜的PIP3协同作用并充当第二信使募集AKT和磷酸肌醇依赖性激酶(phosphoinositol-dependent-kinase 1,PDK1)到膜上，信号转换后，mTORC1通过磷酸化真核起始因子4E结合蛋白 (eukaryotic translation initiation factor 4E binding proteins,4EBP)或核糖体S6蛋白激酶1/2(ribosomal S6 protein kinases,S6K1/2)，促进mRNA释放并增加与翻译起始因子的结合形成活化的翻译起始复合物。活化的S6K通过抑制真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase,eEF2K)活性，使蛋白翻译延伸。mTORC1控制蛋白质生物合成速率、调节细胞生长和增殖必需的大分子合成[24]。KC中的mTOR信号通路被永久激活，使表皮呈现高度异常增殖和成熟分化功能被抑制银屑病。高度活化的PI3K/AKT/mTORC1可抑制角质形成细胞的细胞核自噬功能，在角质形成细胞向成熟的角质细胞分化过程中，高mTORC1活性抑制核降解导致角化不全[25]。mTOR是雷帕霉素的靶蛋白，已有研究表明雷帕霉素在银屑病中有抗增殖和免疫抑制作用，雷帕霉素处理IMQ诱导的银屑病小鼠的皮肤明显病情明显改善，表明局部应用mTOR抑制剂可能成功治疗银屑病[26]。KC的增殖分化平衡在银屑病的发生发展中扮演重要角色，诸多因素参与这一过程，寻找银屑病中与KC更具特异性的相关信号通路，可为临床治疗提供理论依据。

3 银屑病中KC与免疫细胞的相互作用

3.1银屑病早期KC参与固有免疫反应 在银屑病的初始阶段，KC参与DC、中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的募集和活化过程，早期KC在外界应激、创伤、感染、药物的刺激下产生TGF-β1、IL-1、IL-6和抗菌肽SA100家族等炎症因子,使未成熟的DC活化并诱导naive T 细胞向不同效应T细胞亚群分化。报道显示，KC在受到外界刺激后，产生抗菌肽LL-37并与损伤细胞释放的核酸形成复合物，诱导DC表达IFN-γ、IL-6和TNF-α[27]。KC的LL-37通过旁分泌和自分泌通路调节自身IL-1家族细胞因子表达(包括IL-36γ)[28]。此外，KC中LL-37通过IL-36R信号传导诱导CXCL8和CXCL1等趋化因子表达，加速病损皮肤中中性粒细胞的募集。LL-37在银屑病KC中诱导CXCL10和CCL20的表达，可能是DC和Th17在银屑病后期固有性免疫的原因之一。

3.2银屑病慢性期KC诱导适应性免疫 银屑病中DC激活是驱动T细胞分化的决定因素，DC功能的成熟取决于早期先天免疫期期间由KC释放的介质，其中IL-36、IL-1家族可影响DC功能，未成熟的DC在受到这些细胞因子的刺激下活化，并产生IL-12，促使naive T cell 向Th1分化，Th1分泌IFN-γ、TNF-α引发细胞免疫[29]。研究发现，活化的DC同样可产生和IL-12具有共同亚基P40的IL-23，IL-23诱导naive T 细胞向Th17分化，Th17细胞分泌IL-17A、IL-17F、TNF-α、IL-22等。KC表面的IL-17受体IL-17R接受刺激信号后，表达多种趋化因子，包括CCL20、CCL1、CCL2、CCL3、CCL5、CCL8。CCL20可直接募集CCR6+细胞到病损皮肤，并提高β-防御素、S100A家族水平[30]。KC释放的IL-18与IL-12协同作用，通过在银屑病损伤皮肤中诱导IFN-γ而促发Th1应答[31]。γδT细胞浸润可在IL-18存在下通过IL-23信号轴产生IL-17[32]。KC本身作为银屑病发病的起始因素感受外界刺激，产生与正常皮肤不同的细胞因子和趋化因子。病损皮肤KC接受DC和Th17细胞的刺激信号并放大DC-Th17的病理效应，形成正反馈通路使KC增殖分化失去控制导致过度增生并分泌炎症因子。作用于IL-17的药物正处于Ⅲ期临床试验，包括IL-17A单克隆抗体Secukinumab、Ixekizumab和IL-17RA单克隆抗体Brodalumab，随着研究的深入，更多药物将被用于银屑病临床治疗。

4 总结与展望

银屑病的发生是多因素、多信号、多细胞参与的复杂调控过程。KC是炎症反应始动者，与其他免疫细胞相互作用产生炎症信号网络通路影响自身增殖分化及皮肤局部炎症反应。因此KC稳态被打破将诱发疾病。转录组学、病理学、分子生物学等方法使课题组对银屑病中KC的作用机理有了更为深入了解。虽然部分针对KC作为银屑病治疗靶标的生物学方法已取得初步成效，但银屑病中KC细胞的作用机制仍有待进一步研究，以期发现银屑病更有效的治疗方法。