下一代测序技术在乳业中的应用

文/林少华 罗红霞

（北京农业职业学院食品与生物工程系）

乳业产业链包括上游的奶牛养殖业和下游的乳制品加工业。微生物始终影响着乳业产业链的各个环节，传统的微生物分离和鉴定更多的依据可培养和可视化的方式，但随着分子生物学技术的快速发展，下一代测序技术，又称为高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）的出现和成熟，实现了对样品中所有微生物的DNA或RNA直接测序，进而了解微生物群落的组成、分布及动态变化[1]。NGS基于细菌16S rRNA基因及真菌rRNA基因间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）可以快速获取被检测样本的基因序列或碱基对信息，不但省去了传统分离培养法的繁琐过程，且为大量不可培养微生物的研究提供了方法，因其灵敏度高、检测速度快等优点逐步成为食品微生物研究的常规途径之一[2～4]。代表技术有Illuminag公司的Solexa测序技术，Roche公司的454焦磷酸技术，ABI公司的SOLID技术和Pacific Bioscience公司的SMRT技术。随着NGS在乳业的广泛应用，大大提高了乳业行业对微生物的研究进展，其在奶牛养殖和乳制品加工环节微生物的多样性和群落演替分析方面发挥着越来越重要的作用，如青贮饲料的研究、奶牛乳房炎的防治、干酪等乳制品的制作等。因此，本文主要探讨了下一代测序技术在乳业的应用，以期为乳业的发展提供相关研究线索。

1 在奶牛养殖环节的应用

1．1 青贮饲料微生物分析

青贮饲料是奶牛十分重要的口粮，微生物在青贮饲料制作过程中的组成及变化对青贮饲料品质的高低具有非常重要的影响。然而，采用费时、费力且有一定片面性的传统培养法研究青贮饲料中微生物群落的变化具有局限性，无法完全了解微生物的组成、丰度及变化[5]。陶莲等[6]结合实验室检测手段和下一代测序技术，发现玉米秸秆经过青贮发酵后，变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科和魏斯氏菌属菌群数量显著降低，青贮发酵能够显著增加厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科、片球菌属和乳杆菌属菌群数量。这些结果对于分析青贮发酵前、后玉米秸秆品质及菌落构成和丰度的变化，进而为发酵过程的调控提供了理论依据。胡宗福等[7]利用宏基因组学技术，研究和分析了全株玉米青贮发酵过程中和发酵后暴露空气后菌群构成及其演替规律，结果表明，全株玉米经过40 天的青贮发酵，通过IlluminaMiseq测序平台共获得122 371 条高质量有效序列，聚类为239 个操作分类单元，经分类学鉴定分属16 个门，163 个属。在门水平上，厚壁菌门始终占优势。发酵前期、后期和开袋期优势菌属均为乳杆菌属，但在开袋期芽孢乳杆菌属的比例上升明显。因此，全株玉米青贮自然发酵升高了产乳酸乳杆菌属的丰度，有利于提高全株玉米青贮的发酵品质，但开袋暴露空气3 天对全株玉米青贮的微生物多样性产生了影响。这些结果为全面了解全株玉米自然青贮发酵过程中微生物组成及变化、发掘全株玉米附生有益微生物种类、提高青贮饲料营养价值和品质提供理论基础和新方法。Li等[8]采用下一代测序技术研究了大量添加微藻的银草青贮品质，并分析了青贮期细菌群落的变化，发现在青贮发酵过程中检测到30 多个菌属群落结构的变化情况。对于无微藻的样品，1～3 天主要菌属为肠球菌属，之后乳酸杆菌属成为优势属；而添加了微藻的样品中，最常见的是乳酸菌属。

1．2 奶牛瘤胃微生物分析

反刍动物瘤胃中生活着丰富的微生物群体，它们的数量和组成对瘤胃的消化吸收、营养代谢、生长性能和免疫功能等方面具有重要影响[9]。因瘤胃处于厌氧状态，导致其中的微生物人为培养十分困难，限制了对瘤胃微生物的探索研究。随着下一代测序技术的出现与发展，使用该技术研究反刍动物瘤胃微生物的报道越来越多。李子健等[10]研究了不同生理阶段荷斯坦奶牛瘤胃细菌的多样性，发现奶牛从围产前期进入泌乳期后，瘤胃细菌多样性显著降低；而泌乳期各阶段瘤胃细菌组成差异较小。围产前期奶牛瘤胃内的优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门，优势菌科为普雷沃氏菌科；泌乳期奶牛瘤胃内的优势菌门则为拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门，优势菌科为琥珀酸弧菌科和普雷沃氏菌科。日粮中的改变对反刍动物瘤胃微生物组成具有显著的影响，Pitta等[11]采用下一代测序技术研究日粮蛋白质含量的增加对瘤胃微生物的影响发现，高日粮蛋白和低日粮蛋白的瘤胃微生物Chao1指数和Ace指数差异显著，并会促使普雷沃菌属的丰度升高至最高比例。

1．3 奶牛疾病微生物分析

奶牛很多疾病与病原微生物有关，如乳房炎，这是影响奶牛健康的主要疾病之一，会导致患病奶牛产奶量降低、原料奶品质下降，影响奶牛场的经济效益。研究发现，细菌、病毒、真菌、支原体等约150 多种病原体可引起奶牛乳房炎[12]，常见的有金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等[13]。但仍有25%引起临床乳房炎的微生物未能通过可培养的方式检测得到[14]，因此，需要使用分子生物学的方法进行微生物群落结构分析。曾学琴等[15]采用下一代测序技术研究了奶牛乳房炎关联微生物群落的结构及多样性，发现乳房炎奶牛的乳头表面微生物组成与乳房炎奶牛产的牛奶中的微生物组成差异显著，其中乳头表面丰度最高的是厚壁菌门，牛奶中则是变形菌门；乳头表面含有拟杆菌门和梭杆菌门，而牛奶中几乎没有；梭杆菌属仅在乳头表面上检测到，而牛奶中假单胞菌属丰度最高。奶牛患乳房炎后乳头表面及产的牛奶中的微生物群落与正常奶牛产的牛奶存在差异，在患乳房炎的奶牛乳头表面能检测到梭杆菌门，而正常奶牛则未检出；患乳房炎的奶牛乳头表面金黄色酿脓葡萄球菌属丰度高于正常奶牛，肠球菌属仅在患乳房炎的奶牛所产牛奶中检测到，正常奶牛却未检出。Catozzi等[16]的研究也表明，患乳房炎的奶水牛所产水牛奶样品中主要有厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和放线菌门。

1．4 牛床垫料微生物分析

随着公众环保意识的增强，政府执法力度的加大，奶牛场的粪污处理越来越受到重视。除了使用粪污制做沼气或浇灌之外，制作奶牛卧床垫料也是一种有效的回收利用途径。垫料制备过程中的微生物群落组成变化受到环境条件的影响，反过来也会影响垫料本身的质量和奶牛的健康。Sun等[17]采用下一代测序技术探索了细菌和真菌群落在垫料制备不同阶段的动态变化，并对理化参数、微生物群落组成和丰度之间的关系进行了评价。结果发现，垫料中的细菌主要门类有变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门，真菌主要门类为子囊菌门；线性判别分析表明，包括Scedosporiumprolificans在内的多种病原菌在垫料制成后第9天的丰度在不断增加，基于此，提出建议每7天更换一次垫料。

2 在乳制品加工方面的应用

2．1 原料乳微生物分析

原料乳是进行乳制品加工的基础，其质量好坏直接影响乳制品的品质。因此，对原料乳进行微生物尤其是致病菌的检测，保障原料乳质量安全，降低奶牛养殖的风险，从源头上杜绝致病菌的危害非常重要。原料乳的品质受储藏条件、温度和时间等因素影响。姚宇秀等[18]利用IlluminaMiSeq下一代测序技术测定原料乳及其环境中微生物多样性和致病菌的丰度情况发现，输乳管路外侧和盛装原料乳的空贮罐中均检测出金黄色葡萄球菌等致病菌，会对原料乳产生污染，因此，要从源头上健全养殖环境与管理机制。张敏等[19]研究表明，原料乳的菌群以变形菌门为主。在冷藏过程中，Doyle等[20]研究发现，2～6 ℃的贮藏温度下，0～96 h对原料乳中微生物的变化影响小，而泌乳阶段对原料乳中微生物丰度的变化影响更大。

2．2 巴氏杀菌乳微生物分析

巴氏杀菌乳是一种低温杀菌产品，因处理方法温和，不能杀灭原料乳中所有的微生物[21]。其货架期的判断若单纯依靠可培养技术来判断，会因技术问题而被忽略，导致巴氏杀菌乳的贮藏条件和货架期等参数不准确，因为这种检测技术仅能获得实际检测样本中不到1．00%的微生物[22]。Quigley等[23]通过使用下一代测序技术，首次在巴氏杀菌乳样本中鉴定出了类杆菌、粪便杆菌、普雷沃菌和链球菌。该结果分析表明，巴氏杀菌乳中的细菌种群比以前所认识的更加多样，且这些种群中的非热致病菌很可能以一种受损的、不可培养的形式存在，可能对巴氏杀菌乳的质量和保质期均有潜在影响。丁瑞雪等[24]采用下一代测序技术分析了巴氏杀菌乳在0 ℃、4℃、10 ℃条件下分别贮藏0 天、3 天、6 天、9 天、12 天和15天内微生物的群落组成及动态变化。结果表明，不同贮藏温度条件下巴氏杀菌乳中微生物的组成及多样性在门和属水平上差异显著。在0 ℃下贮藏15 天内的巴氏杀菌乳微生物多样性保持最完整，而在4 ℃、10 ℃贮藏期间巴氏杀菌乳的菌群构成及优势菌群都发生了变化，主要菌群变为假单胞菌属和气单孢菌属等。在4 ℃下贮藏9 天、10 ℃下贮藏6 天都出现了类芽孢菌属、沙雷氏菌属，初步推测这两种菌属是导致巴氏杀菌乳品质变化的关键因素。

2．3 UHT乳微生物分析

为了延长牛奶的保质期，常采用超高温瞬时灭菌（Ultra High Temperature treated，UHT）的热处理技术对牛奶中的微生物和芽孢进行完全的破坏，使其无法在常温中生长繁殖。理论上，UHT乳应该是处于无菌状态，然而市场上出现的坏包、胀包等现象表明UHT乳也可能存在微生物。因传统微生物培养分离方法和早期的分子生物学技术对UHT乳中微生物的研究不能客观反映其状态，黄卫强等[25]以宏基因组DNA 16SrRNA基因V1-V3可变区的下一代测序技术，研究了国内两个不同品牌UHT乳样品中微生物多样性，结果表明，两份UHT乳中的微生物主要有厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门四个菌门，该研究侧面反映出下一代测序技术在UHT乳中微生物多样性检测方面的优势。

2．4 酸奶微生物分析

“开菲尔”酸奶是许多国家和地区的传统发酵食品，是一种复合型发酵酸乳。接种的开菲尔粒是一种天然混菌发酵体系，为乳白色、胶质状颗粒。对于开菲尔菌相的研究可以追溯到19世纪末，只有了解其菌相组成才能探讨其发酵过程、代谢机制等问题，从而确保发酵乳的安全性，实现商业化。高洁等[26]采用宏基因组学技术提取开菲尔粒中的总DNA，通过下一代测序技术和生物信息学分析方法得出，乳酸菌和醋酸菌是开菲尔粒中的优势菌相，占细菌总数的90．00%；而其余5 个菌属，包括链球菌属、希瓦氏菌属、明串珠菌属、假单胞菌属和不动杆菌属，占细菌总数的10．00%左右。Nalbantoglu等[27]采用下一代测序技术对两种土耳其开菲尔粒中的微生物多样性进行研究，发现它们的微生物菌落具有高度一致性，乳酸菌属是丰度最高菌属，分别为99．42%和99．79%，该属主要由开菲尔基质乳杆菌、布氏乳杆菌和瑞士乳杆菌三种乳酸菌构成，总丰度分别占该乳酸菌属的97．63%和98．74%。智楠楠等[28]采用下一代测序技术对9种市售酸奶中的微生物多样性进行了分析，结果发现，样品的丰度以厚壁菌门为主占99．60%，其中，链球菌属占87．10%、乳杆菌属占10．30%、乳球菌属占0．30%。

2．5 干酪微生物分析

干酪的制作与微生物有密切的关系，研究其细菌、真菌和霉菌的变化对深入研究干酪质地和风味的形成具有重要的意义[29]。Wolfe等[30]对10 个国家的137 种奶酪表皮微生物群落进行了宏基因组测序，发现了24 种主要的细菌和真菌。Aldrete-Tapia等[31]采用下一代测序技术对意大利Plaisentif半硬质干酪的生产进行了跟踪研究发现，在干酪的生乳期和凝乳期细菌多样性较高，变形菌门和厚壁菌门的丰度最高；在干酪成熟前期和成熟后期微生物多样性降低，主要有厚壁菌门中的乳酸菌属和链球菌属，多为乳酸菌。传统奶酪发酵是由微生物群落共同作用的结果，然而，目前对这些微生物群落的结构、安全性及相互作用等特征的研究仍需要进一步加强。Almeida等[32]采用下一代测序技术建立了奶酪菌群数据库，对其67 个属中137 个物种的142 株菌株进行了基因组测序，包括克吕沃氏菌属，藤黄球菌属和海生乳杆菌属等，这对干酪微生物的群落研究及干酪产品的风味特性研究起到了重要作用。呼斯楞[33]采用宏基因组学研究方法分析了哈萨克斯坦阿拉木图市和江布尔州两个地区采集的6 份自然发酵制成的传统干酪，发现该传统干酪中的优势菌门为厚壁菌门，丰度为92．46%，优势菌属为乳酸杆菌属，丰度为42．12%，优势菌种分别为乳酸乳杆菌（丰度为28．93%）和瑞士乳杆菌（丰度为26．43%）。

2．6 婴幼儿配方奶粉微生物分析

婴幼儿配方奶粉是婴幼儿除母乳外最重要的食品，其安全的重要性不容置疑，因此，对这类产品开展质量安全等关键性指标的研究十分必要[34]。王鸣秋等[35]采用下一代测序技术对14 个婴幼儿食品样本中细菌16S rRNA的V4-V5可变区进行了测序，分析结果表明，羊奶粉样品中占绝对优势菌群隶属于厚壁菌门（丰度为65．58%）和变形菌门（丰度为16．01%），在属水平上以链球菌属（丰度为24．86%）和乳球菌属（丰度为21．44%）为主，为探究婴幼儿奶粉生产的质量控制和监管提供了理论依据。

3 其他与乳相关产品的应用

以动物乳、乳清或乳清粉等为主要原料，经发酵等工艺酿制而成的奶酒，受到发酵菌株的筛选等方面因素的制约[36，37]，影响着奶酒的工业化生产。林少华等[38]采用下一代测序技术，对奶酒的真菌生物多样性进行了检测，结果表明，酵母菌属（Saccharomyces）和曲霉属（Aspergillus）是奶酒主要真菌群落，其中，酵母菌属的丰度约为62．00%，曲霉属的丰度为33．00%。乌日汗等[39]应用IlluminaMiSeq第2代测序技术测定了内蒙古科尔沁地区食疗用酸马奶发酵引子的细菌多样性。发现该样品主要包括乳杆菌属（丰度为84．08%）、醋杆菌属（丰度为9．83%）、乳球菌属（丰度为2．41%）和链球菌属（丰度为2．18%）。

4 展望

随着下一代测序技术及生物信息学技术的发展，宏基因组学将会越来越多的被用于研究乳业中微生物群落结构及其演替规律，以及挖掘传统培养方法无法获得的微生物信息等基础研究。虽然下一代测序的出现为乳业研究微生物提供了一个崭新的平台和广阔的前景，然而面临的挑战仍然存在，局限性仍不容忽视。如该技术依赖的总DNA提取受复杂多样的环境影响；现有的测序技术序列片段短，拼接具有一定难度；宏基因组测序数据量较大，后续数据的分析因算法程序的差异而有较大的变化；测序费用昂贵导致测序重复样本较少，降低了实验结果的再现性等。未来，随着更具优势的三代测序技术应运而生，将为微生物群落结构的研究提供了更加准确可靠的方法。此外，日益丰富和完善的微生物基因组数据库将有利于提高宏基因组数据拼接和注释的效率。宏基因组学、宏转录组学、蛋白质组学和代谢组学的综合运用将有助于更深刻地了解微生物的群落结构演替、相互作用以及对青贮饲料的制作、奶牛疾病的防控、营养物质调控和乳制品的优化和开发等的应用。C