基于UFLC-MS/分子模拟计算的吴茱萸醇提取物中胆碱酯酶抑制剂筛选

王莲萍, 李庆杰, 刘晓艳, 任跃英, 杨秀伟

(1. 吉林农业大学中药材学院, 长春 130000;2. 长春中医药大学附属医院实验中心, 长春 130021;3. 北京大学药学院, 北京 100191)

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸[Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.]、 石虎[Euodiarutaecarpa( Juss. ) Benth.var.officinalis(Dode) Huang]或疏毛吴茱萸[Euodiarutaecarpa(Juss. ) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang]的干燥近成熟果实[1]. 吴茱萸具有温中、 止痛、 理气和燥湿的传统功效, 临床上主要用于治疗寒滞肝脉、 寒疝腹痛、 肝胃虚寒、 浊阴上逆所致厥阴巅顶头痛、 脾肾阳虚等症[2,3], 其改善胃肠功能障碍作用确切[4,5]. 研究发现, 吴茱萸含有生物碱、 萜类、 黄酮、 酚酸、 苯丙素、 挥发油和多糖等多种类型化合物, 其中生物碱和苦味素为其主要成分, 生物碱分为喹诺酮类生物碱、 吲哚类生物碱及其它生物碱[6].

实验结果表明, 吴茱萸与黄连组成的药物可通过调节胆碱能系统改善胃肠功能[7], 推测吴茱萸中可能含有抗胆碱酯酶活性成分. 本文分析了吴茱萸入血小分子化合物的体内药代动力学及各化合物与胆碱酯酶的结合情况, 并探讨了各化合物的构效关系及类药性, 为寻找新的胆碱酯酶抑制剂提供了基础.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

吴茱萸醇提取物为自制(产率为32.6%); 所用的对照品均为自制, 经高效液相色谱法确认纯度均大于95%; 内标卡马西平标准品(批号: 201404)购自食品药品检定研究院; 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购于陕西正一药用辅料有限公司; 肝素钠注射液(批号: 20161202)购自天津生化制药有限公司; 甲醇和乙腈(质谱级)均购于赛默飞世尔科技有限公司; 乙酸铵(色谱级)购于西格玛奥德里奇有限公司; 去离子水由微孔阿尔法-Q水净化系统制得. 其余试剂均为分析纯.

清洁级雄性SD 大鼠9 只, 体重(220±20) g, 由北京大学医学部实验动物中心提供, 合格证号为SCXK(京)2016-0010. 将大鼠置于(24±2) ℃, 湿度为(60±5)% 的环境下, 昼夜节律光照, 自由进食饮水, 饲养7 d以适应环境.

UFLC-MS/MS-8050型液相色谱-串联质谱联用仪(日本岛津公司), 配备有LC-30A二元泵、 SIL-30AC自动进样器、 SPD-M30A PDA 检测器、 CTO-20AC 柱温箱以及电喷雾离子源(ESI); Sigma3K15型高速(冷冻)离心机(德国Sigma公司); MVS-1型涡旋混合器(北京金北德工贸有限公司); KQ5200型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司); LGJ0.5型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂).

1.2 体内药代动力学实验过程

1.2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC®BEH Shield RP-C18色谱柱(1.7 μm, 100 mm×2.1 mm), 配备有同类型的RP-C18 Van Guard TM预柱(1.7 μm, 5 mm×2.1 mm); 以乙腈(B)-0.2 mmol/L乙酸铵水溶液(A)作为流动相, 梯度洗脱程序: 0～8 min, 40%～100%B; 8～10 min, 100%B; 10～10.1 min, 40%B; 10.1～14 min, 40%B; 流速0.4 mL/min; 柱温30 ℃; 进样量1 μL.

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源, 干燥气体N2流量10 L/min, 雾化气体流量3 L/min, 加热气体流量10 L/min, 界面温度300 ℃, 脱溶剂温度250 ℃, 加热温度400 ℃, 接口电压3 kV, 检测电压1.8 kV. 具体参数列于表1.

Table 1 Information of compound ionization*

*Q1: Quadrupole 1 pre-rod bias;Q3: quadrupole 3 pre-rod bias; CE: collision energy.

1.2.3 样品制备 取30 g醇提取物粉末溶于适量的水中, 加入1 g CMC-Na助溶, 超声溶解, 并加水定容至100 mL, 得均匀灌胃混悬药液, 备用.

将SD雄性大鼠随机分为2组: 空白组3只, 给药组6只. 禁食12 h后, 对给药组的大鼠均按照10 g/kg(药材/体重)平行灌胃给药, 空白组大鼠给予同等体积的饮用水, 并分别在0.16, 0.33, 0.5, 1.0, 1.5, 2, 3, 5, 6, 8, 12和24 h时眼眶静脉丛取血适量, 置于提前准备好的肝素钠EP管中, 以6000 r/min转速离心10 min, 取上清液即得血浆样品[8].

精确吸取100 μL血浆样品于干净的1.5 mL EP管中, 加入100 μL 1 μg/mL的卡马西平内标溶液, 再加入500 μL甲醇, 涡旋混匀5 min, 再以10000 r/min离心10 min, 取上清液至新的EP管中, 40 ℃条件下用N2气吹干浓缩, 残渣加入100 μL甲醇复溶, 超声溶解5 min, 以10000 r/min离心10 min, 取上清液, 用0.22 μm微孔滤膜过滤, 于-20 ℃下储存待UFLC-MS分析[8].

1.2.4 数据处理 采用平均值±SD 表示, 所得数据用winnonlin6.4软件进行处理, 选用统计矩模型, 计算各化合物的药时曲线下面积(AUClast和AUC0→inf)、 平均滞留时间(MRT)及消除半衰期(t1/2z)等体内药代动力学参数.

1.3 分子对接方法

从蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)下载与多奈哌齐(donepezil)复合的乙酰胆碱酯酶(pdb ID 1EVE)[9,10]的晶体结构[图1(A)]. 采用AutoDock Tools制备受体pdbqt文件, 移除共结晶配体和水分子的转移、 加氢和分配电荷. 使用AutoDock Vina[11]进行对接, 在由共结晶受体配体多奈哌齐定义的活性位点区域中产生对接网格, 对接盒子为2.0 nm×2.0 nm×2.0 nm, 中心坐标x=2.277,y=63.750,z=65.500. 每个配体进行5次对接, 均产生20个构象, exhaustiveness为20. 为了确保分析的有效性, 有必要对方法进行验证; 为此, 采用与配体相同的参数实现了共结晶配体多奈哌齐的重新对接. 比较了多奈哌齐和共结晶的最佳结果, 均方根偏差(RMSD)为0.11 nm, 低于0.15～0.2 nm, 适用于预测配体构象[12]. 对最后的结果采用PyMOL, PLIP[13]和Discovery Studio Visualizer进行分析和对接构象的可视化.

从蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)下载丁酰胆碱酯酶(pdb ID 1P0I)[10,14]的晶体结构[图1(B)]. 采用AutoDock Tools制备受体pdbqt文件, 移除水分子, 加氢和分配电荷. 使用AutoDock Vina进行对接, 首先分析催化位点和外周位点, 其中Ser198为催化丝氨酸, Asp70为外周阴离子位点, 设置对接盒子为2.0 nm×2.0 nm×2.0 nm, 中心坐标x=138.006,y=119.308,z=42.047. 每个配体进行5次对接, 均产生20个构象, exhaustiveness为20. 对最后的结果采用PyMOL, PLIP和Discovery Studio Visualizer进行分析和对接构象的可视化.

Fig.1 Butt pocket of acetylcholinesterase(A) and butylcholinesterase(B)

所有的配体结构式、 名称及3D结构生成方式列于表S1(见本文支持信息).

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

根据实验[15,16]分析, 各个化合物的特异性结果见图2.

Fig.2 Specificity of 10 compounds in fructus evodiae(A) Blank plasma samples added the standard compounds; (B) blank plasma samples. a—j. dehydroevodiamine, wuchuyuamide Ⅰ, evodiamine, rutaecarpine, 1-methyl-2-nonyl-4(1H)-quinolone, 1-methyl-2-[Z-6-undecenyl]-4(H)-quinolone, evocarpine, 1-methyl-2-pentadecadienyl-4(H)-quinolone, dihydroevocarpine, 1-methyl-2-pentadeceny-4(H)-quinolone, respectively.

血浆中各个化学成分的线性回归方程、 定量限(LLOQ)和检测限(LLOD)结果列于表S2(见本文支持信息). 可见, 所有标准曲线的R2≥0.9959, 表明线性关系良好.

根据分析结果可知, 吴茱萸中10个分析物的日内、 日间精密度的相对标准偏差(RSD)值均小于13.13%, 准确度的RSD值均小于14.52%, 说明误差在可控范围内, 所建分析方法可行. 具体结果列于表S3(见本文支持信息).

血浆样品在室温放置、 反复冻融3次以及低温条件下存放20 d后的稳定性RSD值均小于6%, 说明稳定性良好. 具体结果列于表S4(见本文支持信息).

吴茱萸中10个不同浓度分析物的提取回收率在63.2%～101.7% 之间, RSD均小于13.6%, 基质效应在84.6%～109.3% 之间, 说明该分析方法可以用于吴茱萸中所标示化合物的快速检测和分析. 具体信息列于表S5(见本文支持信息).

2.2 药代动力学

所得化合物的血药浓度-时间曲线见图3, 体内药代动力学参数列于表S6(见本文支持信息).

从图3可知, 将大鼠灌胃给予吴茱萸乙醇提取物之后, 10个化合物均能被胃肠道快速吸收, 给药10 min左右均可测到血清中药物浓度, 大多数药物血药浓度在1～2 h左右达到峰值. 而二氢吴茱萸卡品碱、 吴茱萸碱和1-甲基-2-十五二烯基-4(1H)-喹诺酮达到峰值时间约为2.5～3 h, 说明这3个化合物的胃肠吸收速度低于其它化合物. 4个喹诺酮类化合物达到峰值后, 随着时间的延长, 血药浓度迅速降低, 但经过一段时间后在血浆内仍能检测到该类成分的存在, 可见其吸收具有吸收快, 消除快, 滞留时间久的特性.

此外, 大鼠在灌胃吴茱萸醇提物后, 去氢吴茱萸碱、 吴茱萸卡品碱和吴茱萸酰胺Ⅰ在血浆中存在一个缓慢下降的过程, 但基本在24 h内消除完毕. 由表S6可知, 吴茱萸次碱的半衰期在13 h左右, 作为一种潜在的长半衰期药物, 可以在继续探究其活性和剂型的基础上减少给药次数. 除吴茱萸次碱外, 其它化合物的平均半衰期约为1～3 h, 反映了这些化合物在体内存在较快的生物转化或消除过程.

同时, 吴茱萸给药后, 去氢吴茱萸碱、 二氢吴茱萸卡品碱、 1-甲基-2-十五二烯基-4(1H)-喹诺酮、 1-甲基-2-十五烯基-4(1H)-喹诺酮、 吴茱萸碱、 吴茱萸卡品碱和1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹诺酮暴露量较高, AUC范围为2937.631～16514.501 ng·h/mL, 说明生物利用度高. 但1-甲基-2-[Z-6-十一烯基]-4(1H)-喹诺酮、 吴茱萸次碱和吴茱萸酰胺Ⅰ暴露量较低, AUC范围为565.001～1819.277 ng·h/mL.

2.3 分子对接结果

2.3.1 10个生物碱与乙酰胆碱酯酶的对接 通过分子对接软件Vina筛选10个生物碱, 发现10个生物碱均具有与乙酰胆碱酯酶对接的可能性, 其中活性最高的是去氢吴茱萸碱(-48.95 kJ/mol)、 吴茱萸碱(-48.53 kJ/mol)、 吴茱萸次碱(-47.28 kJ/mol)和吴茱萸酰胺Ⅰ(-46.02 kJ/mol), 其对接打分均在-46.02 kJ/mol以下.

乙酰胆碱酯酶的活性位点在受体表面腔深约2.0 nm处, 除了位于腔底部的酶的催化三联体(Ser200, His440和Glu327)外, 已确定几个残基是配体相互作用的重要区域, 如Trp84, Phe330, Glu199和Gly441形成的中心阴离子位点(CAS)及Trp279, Tyr334, Tyr121和Tyr70形成的外周阴离子位点(PAS).

分析10个化合物与乙酰胆碱酯酶主要的作用残基为Trp84, Phe330, Phe331, Tyr334的疏水贡献和 Tyr334和Trp84的π-π堆积贡献. 同样的反应也存在共结晶配体多奈哌齐中, 如典型的Trp84, Phe330, Phe331, Tyr334的疏水反应, Trp84的π-π堆积反应[17,18]. 对接结果及结合模式分别列于表S7和图S1～图S4(见本文支持信息).

打分最好的4个化合物与乙酰胆碱酯酶作用模式如下: (1) 去氢吴茱萸碱, Tyr121与亚氨基形成氢键, 距离为0.279 nm, 角度为120°. 其中起结合能贡献的主要作用为氨基酸残基Trp84, Phe330, Phe331和Tyr334与其的疏水作用. (2) 吴茱萸碱, Ser122与其羰基形成氢键, 距离为0.35 nm, 角度为127.5°. 另一个典型的相互作用是与Tyr334的π-π堆积, 距离约在0.4 nm. Trp84, Phe330, Phe331和Tyr334与其的疏水作用贡献主要的结合能. (3) 吴茱萸次碱, Tyr121与亚氨基形成氢键, 距离为0.268 nm, 角度为124.7°, 其中起结合能贡献的主要作用为Trp84, Phe330, Phe331和Tyr334与其的疏水作用. (4) 吴茱萸酰胺Ⅰ, Tyr121和Ser122与其形成2个较弱的氢键, Trp84和Tyr334的π-π堆积及Phe330和Phe331的疏水作用贡献主要的结合能.

其余6个化合物的对接打分较低, 均在-39.33 kJ/mol以上, 它们的典型特点是具有长的脂肪链, 由于结合口袋埋藏在腔内, 所以它们结合需要弯曲和折叠, 这些空间位阻导致它们具有较低的结合亲和力[19～21].

2.3.2 10个生物碱与丁酰胆碱酯酶的对接 通过分子对接软件Vina筛选10个生物碱, 发现10个生物碱均具有与丁酰胆碱脂酶对接的可能性, 其中活性最高的是吴茱萸酰胺Ⅰ(-46.86 kJ/mol)、 吴茱萸碱(-46.02 kJ/mol)、 去氢吴茱萸碱(-43.93 kJ/mol)和吴茱萸次碱(-42.67 kJ/mol), 其对接打分均在 -41.84 kJ/mol以下. 与乙酰胆碱酯酶的筛选结果一致.

分析10个化合物与丁酰胆碱脂酶主要的作用为Asp70, Trp82, Thr120, Trp231, Leu286, Val288, Ala328, Phe329, Tyr332, Phe398, Trp430和Tyr440的疏水以及Trp82, Trp231和phe329的π-π堆积. Thr120以及催化残基Ser198与配体的羰基形成氢键. 对接结果及结合模式分别见表S8和图S5～图S8(见本文支持信息).

打分最好的4个化合物与丁酰胆碱酯酶作用模式如下: (1) 吴茱萸酰胺Ⅰ, Ser198与羰基形成氢键, 距离为0.29 nm, 角度为163.8°, His438与其亚氨基形成氢键, 距离为0.32 nm, 角度为136.1°. 6个疏水氨基酸Leu286, Val288, Ala328, Phe398, Trp430, Tyr440与其形成疏水相互作用. 2个色氨酸Trp82和Trp231具有大的芳香环, 与其形成π-π堆积作用. (2) 吴茱萸碱, Ser198和His438与其亚氨基形成氢键, Thr120与其羰基形成氢键, 距离为0.31 nm, 角度为161.3°. 另一个典型的相互作用是与Trp231和Phe329形成π-π堆积作用, 距离约在0.5 nm以上. (3) 去氢吴茱萸碱, Ser198与羰基形成氢键, 距离为0.32 nm, 角度为168.9°, Asp70, Thr120, Trp231, Leu286, Val288和Phe398与其形成疏水作用. (4) 吴茱萸次碱, Ser198与羰基形成氢键, 距离为0.31 nm, 角度为169.0°, Asp70, Thr120, Trp231, Leu286, Val288, Phe398与其形成疏水作用. Trp231和phe329形成π-π堆积作用. 这4个化合物均与丁酰胆碱酯酶催化残基Ser198形成氢键, 距离为0.3 nm, 角度为168°左右, 是一个较强的氢键.

其余6个化合物的对接打分较低, 均在 -35.15 kJ/mol以上, 这6个化合物典型的特点是具有长的脂肪链, 由于结合口袋埋藏在腔内, 所以这些化合物结合需要弯曲和折叠, 这些空间位阻导致它们具有较低的结合亲和力[22,23].

3 结 论

建立了一套快速、 高效、 灵敏的检测吴茱萸醇提取物中10种生物碱类成分(包括4种吲哚型生物碱及6种喹诺酮类生物碱)的生物学测定方法, 并测定了其体内药代动力学行为, 10个生物碱类化合物与乙酰胆碱脂酶和丁酰胆大碱脂酶对接结果表明, 吴茱萸碱、 吴茱萸次碱、 去氢吴茱萸碱和吴茱萸酰胺Ⅰ是2个对接体系中对接打分最好的4个化合物, 可能它们具有对乙酰胆碱脂酶和丁酰胆碱脂酶的双重抑制, 是在吴茱萸总成分中起到主要抑制作用的活性化合物. 并发现10个化合物与乙酰及丁酰胆碱酯酶均进行模拟对接时, 吲哚型生物碱的结合力均较好, 明确了作用位点及构效关系, 为开发新型胆碱酯酶抑制剂提供基础.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190311.