基于Wnt/β-catenin信号通路的中医药调控骨代谢研究进展

蔡鑫 唐芳 马武开 周静 兰维娅 李宇 蒋总 樊梅

(1贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2贵阳中医学院第二附属医院)

骨组织生命活动周期包括骨吸收和骨形成，这一过程被称为骨重塑，其中间充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞起主导作用〔1，2〕，对维持人体骨量和体液中钙离子浓度十分重要。在骨重塑中，骨吸收与骨形成的协调失衡会导致骨质减少甚至骨质疏松，许多与骨代谢异常相关的疾病如骨质疏松、类风湿关节炎等的发生与骨质流失密切相关。Wnt/β-catenin通路是骨骼发育和骨骼内稳态的重要调节通路〔3～6〕，能调节Wnt途径相关因子的表达，激活细胞向成骨细胞分化或使正常骨细胞代谢受抑制。其调控骨细胞生命过程具有双面性，例如Wnt联合受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5功能缺失使骨量下降，其激活突变则引起高骨量的发生；细胞厚体(DKK)1的高表达抑制骨形成，使用DKK1拮抗剂后可促进成骨分化。研究中医药调控Wnt/β-catenin信号通路与骨代谢相关机制已逐渐成为热点，已有较多学者取得了一定成果，这对于发挥中医药潜在治疗优势具有重要意义〔7～10〕。

1 Wnt/β-catenin信号通路

在哺乳动物中已发现的Wnt蛋白家族成员至少有19种，大多数在细胞内诱发相应的特定作用，只有少部分具有相同功能。但是从生化层面来看，不同的Wnts对其表面受体卷曲蛋白(Fzd)的影响却很相似，均与Fzd在富含半胱氨酸的N端相互作用而发挥生物效应〔11〕。Wnt/β-catenin信号通路的激活基于Wnt蛋白和其受体的结合，进一步决定了下游基因的表达〔12〕。在正常稳态下，被磷酸化的β-catenin与轴蛋白(Axin)、结肠腺瘤样息肉病基因编码的蛋白(APC)和糖原合成酶激酶(GSK)-3β组成降解复合物，在该复合物中β-catenin被泛素化标记并进一步降解，细胞内β-catenin水平较低〔13〕。Wnt/β-catenin信号通路被激活时，分泌出的Wnt蛋白通过结合跨膜受体Fzd和LRP5/6启动信号传导，诱导LRP5/6的尾部磷酸化，将Axin招募至细胞膜下并与磷酸化位点结合，Axin移除后，β-catenin在降解复合物中被蓬乱蛋白(Dsh)释放出来，因此β-catenin在细胞质中聚集，最终转移到细胞核，与T细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF/LEF)结合而启动靶基因转录〔14，15〕。Wnt信号通路的拮抗剂如骨硬化蛋白(SOST)、Dickkopfs(DKK1/2/3)和分泌型卷曲相关蛋白(sFRP)1通过直接与Wnt蛋白结合或干扰Wnt蛋白与其受体间的相互作用而阻止β-catenin向核内移位〔16〕。

影响Wnt/β-catenin途径的因素众多，包括LRP5/6、多种由Wnt基因编码的激活蛋白及一些抑制剂如SOST、Dickkopfs、sFRP1等，但是这些因子的共同作用靶点都是β-catenin，将胞质内的β-catenin降解失活或促使其转移向核内与靶基因相互作用，调控经典Wnt/β-catenin通路。

2 Wnt/β-catenin信号通路与骨代谢

Wnt/β-catenin信号通路通过调节成骨细胞骨形成活性和破骨细胞骨吸收功能而调控骨代谢，对维持正常骨量至关重要，已有研究证实该通路是刺激成骨细胞增殖、分化活性的关键信号通路〔17～20〕。大量细胞和调节因子〔21〕参与维持骨重塑平衡，包括破骨细胞、成骨细胞、骨细胞和MSCs；Runt相关转录因子(Runx)2、Osterix转录因子、碱性磷酸酶(ALP)、一型胶原蛋白(COL1A1)等。在这些类型的细胞中，由多核细胞和MSCs分化而来的破骨细胞和成骨细胞分别负责骨吸收和骨形成〔22～24〕。

2.1骨形成 激活经典Wnt/β-catenin途径能够诱导成骨细胞的分化和矿化，抑制成骨细胞和骨细胞的凋亡而促进骨形成〔25～27〕。以β-catenin为代表的正向调控蛋白能激活下游TCF/LEF等因子促进骨细胞增殖〔28〕。有研究显示Wnt蛋白通过与LRP5/6和Fz绑定，抑制GSK-3β活性而促进胞质β-catenin的稳定〔29〕。成骨细胞的分化可促进Runx2、Osterix、COL1A1等的表达和分泌〔30，31〕。Runx2在成骨细胞分化中直接与成骨细胞关键性特异基因的启动区域相互作用促进成骨细胞发育〔32〕。COL1A1是由成骨细胞分泌产生的糖蛋白，为骨细胞外基质的重要组成部分，共同在骨重塑中发挥重要作用〔33〕。Runx2和Osterix调控着多种成骨细胞标记基因的表达，如ALP和COL1A1〔34〕。胡中青等〔35〕证实通过激活Wnt/β-catenin信号通路能上调RunxZ和Osterix表达，有效促进骨髓MSCs(BMSCs)向成骨分化发育、改善骨缺损。

2.2骨破坏 Glass等〔36〕在对老鼠基因的研究中首次报道了Wnt/β-catenin信号通路对于破骨细胞的重要性，下调细胞内β-catenin的表达会影响MSCs向成骨细胞分化，导致骨形成能力减弱，骨密度下降〔37，38〕。LRP5是骨重塑关键调控因子，此基因缺失会使成骨增殖分化功能下降〔39〕。小鼠骨组织内DKK1呈高水平表达时，成骨分化明显受到抑制〔40〕。Osterix特定表达在发育骨骼中，当其被选择性敲除后会导致小鼠骨形成障碍，对调控骨形成和骨吸收有重要意义〔41，42〕。Sclerostin是一种由SOST基因编码，经骨细胞分泌产生糖蛋白，通过与成骨细胞上LRP5/6的细胞外区域结合抑制经典Wnt/β-catenin通路，从而负向调控骨形成〔43〕，而使用SOST拮抗剂可增加骨形成和减少骨吸收，使骨质量、骨密度迅速增加〔44〕，并且这一结果已在临床人体试验中得到肯定〔45，46〕。此外，多种其他类型Wnt信号通路拮抗剂在骨骼代谢中抑制成骨分化的作用也在小鼠模型中被证实〔47〕。

3 中医药调控Wnt/β-catenin信号通路与骨代谢

中医药通过Wnt/β-catenin信号通路调控骨代谢的机制较为复杂，对该通路中相关调控因子产生复合影响而非只对单一蛋白起作用。当前的研究主要是单味中药有效提取物和中药复方制剂，所影响的调节因子广泛，包括正向调控因子Wnts、LRP5、Runx2和负向调节蛋白DKK1、SOST、GSK-3β等。

3.1中医药干预正向调控因子

3.1.1Wnt蛋白与骨代谢 BMSCs通过自身较强的自我更新和多向分化能力而维持机体骨量，具有低免疫原性和易获取等特点〔48，49〕。复方贞术调脂胶囊能有效提高骨组织中Wnt3a表达，经干预后的BMSCs中促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MEKK)2和β-catenin蛋白表达明显上调，说明该方通过调控MEKK2-Wnt耦联抑制β-catenin被降解而促进成骨分化〔50〕。章建华等〔51，52〕以骨质疏松(OP)肾阴虚和肾阳虚两种证型为研究点，发现左归丸和右归丸含药血清均能上调大鼠成骨细胞中β-catenin mRNA和蛋白表达，提升ALP的活性，对成骨细胞增殖具有积极作用。但是左归丸对于肾阴虚证型OP成骨细胞的促进作用更明显，而肾阳虚证型OP中右归丸的效果更强，与“左归丸补肾阴，右归丸补肾阳”的经典中医理论相符。氧化应激会诱导成骨细胞凋亡使骨量下降而引发OP，叉头框O蛋白家族(FoxO)在此过程中起关键作用，FoxO和β-catenin结合后，β-catenin与TCF的转录作用被竞争性抑制而减少成骨细胞形成〔53，54〕。激活Wnt/β-catenin信号通路能抑制上述反应过程〔55，56〕，成鹏等〔57〕构建去卵巢大鼠OP模型，观察到经黄芪甲苷干预后用酶联免疫吸附试验(ELISA)测得Wnt2a和β-catenin蛋白表达水平明显上调，FoxO蛋白家族成员FoxO3a表达受到抑制，能有效调节成骨细胞代谢、改善大鼠骨量减少所致的OP。

3.1.2LRP5与骨代谢 陈云刚等〔58〕使用骨碎补含药血清干预大鼠BMSCs，发现其通过激活Wnt/β-catenin信号通路，上调LRP5、β-catenin mRNA和蛋白表达及提升ALP的活性，促进BMSCs向成骨分化。DKK1的高表达会抑制成骨细胞代谢，何帮剑等〔59〕发现益骨汤含药血清能有效提高大鼠骨组织LRP5基因表达而促进成骨细胞增殖，这可能与抑制经典Wnt/β-catenin通路中DKK1的表达有关。彭昕等〔60〕采取由补骨脂丸为原方而研制出的壮骨止痛胶囊〔61〕干预体外培养大鼠颅骨成骨细胞的方法，观察到药物组LRP5和β-catenin蛋白表达明显升高，可能具有与雌激素相似的治疗绝经后OP的作用。还有学者发现益骨汤含药血清也能通过上调骨组织Wnt/β-catenin信号通路LRP5、β-catenin mRNA和蛋白的表达来促进成骨细胞增殖〔59〕。

3.1.3Runx2与骨代谢 史岩等〔62〕用RT-PCR法检测经骨碎补黄铜干预后的体外培养大鼠BMSCs，结果显示Runx2、β-catenin mRNA表达明显上调，表明该方通过上调Wnt/β-catenin通路关键活化因子表达来促进BMSCs向成骨细胞分化。在另一项研究中也发现通过提高Runx2的表达有利于成骨分化〔58〕。黄精多糖可激活经典Wnt/β-catenin通路而促进MSCs成骨分化〔63〕，彭小明等〔64〕进一步证实黄精多糖能明显提升成骨关键转录因子Runx2、ALP活性，激活β-catenin易位到细胞核与成骨靶基因Runx2结合启动转录。益骨汤具有上调大鼠骨组织Wnt/β-catenin信号通路成骨分化核心蛋白Runx2表达而调控成骨增殖过程的作用〔65〕。银杏叶提取物通过刺激Runx2基因表达和提高ALP活性对细胞成骨分化起积极作用，COL1A1、β-catenin等蛋白表达也明显上调〔66〕。

3.2中医药干预负向调控因子

3.2.1DKK1与骨代谢 成骨细胞增殖分化活性能被破骨细胞间接抑制而使骨量减少〔67〕，清热活血方可以显著下调类风湿关节炎大鼠模型滑膜与血清中DKK1 mRNA和蛋白表达，通过Wnt/β-catenin通路调节破骨细胞与成骨细胞的分化平衡来抑制骨破坏〔68〕。杨文雪等〔69〕发现补肾舒脊颗粒通过上调DKK1和SOST而抑制强直性脊柱炎患者受累关节骨化过程，同时抑制Wnt5a和β-catenin mRNA表达，影响Wnt通路对骨细胞的调控，这与鄢泽然等〔70〕的研究结果一致。使用菟丝子黄酮混悬液灌胃去卵巢大鼠一方面抑制了DKK1的表达、增强成骨分化，另一方面能提升血液中β-catenin水平、抑制破骨细胞成熟〔71〕。张志达等〔72〕研究左归丸对糖皮质激素性OP大鼠骨量的影响，结果显示左归丸能较好改善骨质量，其机制可能是通过下调DKK1 mRNA表达、增强成骨细胞活性而发挥抗OP作用。

3.2.2SOST与骨代谢 补肾健脾活血方不仅能提高被沉默SOST腺病毒载体传染的成骨细胞增殖能力和ALP活性，上调骨保护素和骨桥蛋白表达，而且当过表达SOST感染后也能取得类似的干预效果，表明该方可能是通过调控Wnt信号通路中SOST的表达来发挥骨重建作用〔73，74〕。柴生颋等〔75〕通过建立sFRP1高表达及沉默组基因载体并联合补肾方药含药血清干预大鼠骨肉瘤细胞，发现补肾方药在一定程度上抑制sFRP1的表达，提高细胞中β-catenin蛋白水平而调控骨代谢。

3.2.3GSK-3β、Axin与骨代谢 有学者使用刺老苞根皮含药血清干预体外培养的大鼠成骨细胞后，经Western印迹和荧光定量PCR法测得Axin mRNA和蛋白表达明显下调，有效提高了β-catenin mRNA和蛋白表达，成骨分化与增殖功能得到加强，其机制可能与由Axin、β-catenin、APC、GSK-3β等组成的降解复合物被破坏相关〔76〕。张哲等〔77〕采取老鹳草素干预小鼠BMSCs的方法研究其作用机制，发现经药物作用后GSK-3β mRNA和蛋白表达明显下调，同时激活Wnt3a蛋白的表达，而DKK1可以抑制该过程，说明老鹳草素是通过激活Wnt3a/β-catenin通路发挥诱导BMSCs增殖和向成骨方向分化的作用；而涂艳等〔78〕则发现淫羊藿苷能上调GSK-3β mRNA表达，提升β-catenin和Wnt10a等蛋白水平来调控BMSCs向成骨分化。此外也有研究显示淫羊藿苷能抑制破骨细胞活性，用于治疗骨量下降诱发的OP有较好效果〔79，80〕。

综上所述，基于中医药调控Wnt/β-catenin影响骨代谢的机制十分复杂，既可通过上调正向调控因子mRNA和蛋白的表达来促进成骨细胞增殖分化，维持正常的骨量；也能拮抗该通路负向调节因子的表达而抑制破骨细胞活性，使骨形成和骨吸收这一骨重塑过程稳定在动态平衡状态。目前采用针对Wnt/β-catenin信号通路的生物制剂进行治疗骨代谢病已表现出较好的早期效果，并可能在不久的将来进入临床领域，如抗DKK1蛋白抗体等治疗药物的研发不仅可以促进骨形成，还有望逆转骨质疏松、类风湿关节炎等造成的骨质流失。中医药可调节的Wnt/β-catenin骨代谢相关转录因子较多，如果能对其干预机制有更深层次、更详尽的认识，这相对于干预单一靶基因可能效果更佳。因此，中医药治疗骨代谢性疾病具有极大的潜力，应当进一步增强研究力度，充分研发并使之临床应用成为现实。