离子液体[C3mim]BF4对小白菜幼苗抗氧化特性的影响

2020-01-15阮亚男邢晓琳崔智昕

核农学报 2020年1期

阮亚男韩阳邢晓琳崔智昕孟靖

(辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳 110036)

离子液体是由有机阳离子与有机或无机阴离子构成,在室温或者使用温度下呈液态的一种新型的有机溶剂[1],因其环境友好的特性而被称为绿色溶剂,在化学工程、生物技术、材料、液态晶体等多个领域都有广阔的应用前景[2]。离子液体不易挥发,在空气中稳定性高,不易造成大气污染,但其在水体中溶解度高,极易造成水体污染。离子液体的深入研究及广泛应用发现[2],离子液体在意外泄露、工业污水排放等情况下易通过水循环进入生态系统,对水生生物及土壤生态系统造成影响,最终威胁人类健康。因此,离子液体环境友好型及其对环境和生物安全性受到了广泛关注[3]。

咪唑类离子液体具有电导率高、粘度高的特点,是目前广泛应用的绿色溶剂之一。该离子液体在水体及土壤中的生物降解性较差,具有生物毒性[4],其毒性与取代基烷基链长度成正比,对植物、土壤微生物、土壤动物等都具有一定的毒害作用。研究发现离子液体对植物的生长发育有抑制作用,进入植物体可与生物大分子蛋白和DNA直接或间接发生反应,影响DNA及蛋白质结构的稳定性,损坏细胞壁、增大细胞膜透性,引发毒性反应。但离子液体亦可影响植物叶绿素a的产生,诱发氧化应激,以应对非生物胁迫的影响[4-5]。在植物启动抗氧化系统的同时,抗氧化系统主要酶及相关的抗逆基因表达必然受到影响。目前,关于离子液体对植物影响的研究已有大量报道[4-5],但多集中在个体水平,而在分子转录水平的相关研究尚鲜见报道。本试验以我国各地普遍栽培的蔬菜作物小白菜为试验材料,研究离子液体1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸([C3mim]BF4)对其种子萌发、幼苗生长、抗氧化系统的影响及其分子机制,以期为揭示咪唑类离子液体毒性机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

供试小白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensisMakino)品种为青梗1号,购自辽宁省沈阳农业大学农资站。

离子液体[C3mim]BF4,结构如下:

由辽宁大学关伟教授提供,其核磁共振氢谱和文献[6]相符,样品纯度99%。其他试剂均为分析纯,购自上海生物工程有限公司。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 试验材料的培养选取颗粒饱满的小白菜种子,用0.1%HgCl2浸泡10 min,无菌水反复冲洗3次。分别用 0(CK)、100、200、300、400、500 mg·L-1[C3mim]BF4水溶液浸泡种子12 h,将浸泡处理过的种子平铺在滤纸上,每皿铺入100粒。在培养皿中加入20 mL含对应浓度[C3mim]BF4的Hoagland营养液,以后每天向培养皿中添加相应的营养液1次,每次5 mL。将培养皿放在人工气候箱中,24±1℃恒温培养,每天光照时间12 h。每个处理3次重复。

1.2.2 发芽率和株高的测定

于培养第7天按照公式计算发芽率:

于培养第20天,从每个浓度的3个平行中,各随机取10株小白菜幼苗,用于测定株高。株高为从茎基部到最长叶片的长度。

1.2.3 生理生化指标的测定于培养第20天,在每个浓度的3个平行中随机取样进行生理指标测定。超氧阴离子自由基()产生速率采用羟胺法[7]进行测定；过氧化氢(H2O2)含量测定采用硫酸钛法[8]；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法[9]；脯氨酸(proline,Pro)含量测定采用酸性茚三酮法[10]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定采用氮蓝四唑蓝(nitroblue tetrazolium,NBT)光还原法[11]；过氧化氢酶(catalase,CAT)活性测定采用紫外吸收法[12]；抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性测定采用紫外分光光度法[13]；谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)活性测定采用紫外分光光度法[14]。

1.2.4 RNA提取和RT-PCR分析选取颗粒饱满的小白菜种子,用0.1%HgCl2消毒后用无菌水浸泡12 h,然后铺在培养皿中,每皿100颗。在培养皿中加入Hoagland营养液20 mL,直至发芽。在培养第7天,用含400 mg·L-1[C3mim]BF4的Hoagland营养液培养幼苗,随后每天向培养皿中添加相应的营养液1次,每次5 mL。培养条件:24±1℃,光照时间为每天12 h。分别于[C3mim]BF4处理 0、1、3、6、12、24 h 和 13 d 时取小白菜幼苗叶片,立即置于液氮中冷冻,并保存于-80℃冰箱。采用植物总 RNA提取试剂盒(华越洋生物公司生产)提取材料的总RNA,并反转录成cDNA。

参考钟友明[15]的引物序列(表1),扩增小白菜Cu/Zn-SOD(AF071112)、APX(GQ500125)和CAT(U68219.2)。以β-actin(GQ339782)作为内参,调整每个处理的cDNA模板量一致。PCR扩增体系为25 μL,包括 0.5 μL Taq,10 mmol·L-1dNTP Mixture 0.5 μL,5 μmol·L-1正向引物和 5 μmol·L-1反向引物各 0.5 μL,40 ng·μL-1cDNA 模板 2.5 μL,18 μL ddH2O。PCR扩增程序:94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1 min,35循环；72℃延伸10 min。所有PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primers information

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析；LSD进行多重比较,显著性以P值表示,P＜0.05表示差异显著。RT-PCR电泳图条带采用Image J软件进行灰度值分析。

2 结果与分析

2.1 [C3mim]BF4浓度对小白菜发芽率和株高的影响

由表2可知,100～300 mg·L-1[C3mim]BF4对小白菜种子萌发无显著影响,发芽率与CK相比无显著差异；而400～500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组种子发芽率显著低于CK,且500 mg·L-1[C3mim]BF4处理的发芽率显著低于400 mg·L-1[C3mim]BF4处理组。表明较低浓度[C3mim]BF4对小白菜种子萌发无影响,而300～500 mg·L-1[C3mim]BF4则抑制种子萌发。

株高变化是植物遭受胁迫时从外观上表现的症状之一。100～400 mg·L-1[C3mim]BF4处理组小白菜株高与CK间无显著差异,而500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组小白菜株高较CK显著降低36.74%(P＜0.05)。说明100～400 mg·L-1[C3mim]BF4对小白菜幼苗生长无显著影响,而高浓度[C3mim]BF4则抑制幼苗生长。不同浓度[C3mim]BF4对小白菜种子萌发和幼苗生长的影响存在差异,其中400 mg·L-1[C3mim]BF4抑制小白菜种子萌发,500 mg·L-1[C3mim]BF4抑制了小白菜种子萌发和幼苗生长,且其对幼苗生长的抑制作用大于对种子萌发的影响,此结果符合植物发育的不同阶段抗性不同的特点。

表2 [C3mim]BF4浓度对小白菜发芽率和株高的影响Table 2 Effect of[C3mim]BF4concenation on germination percentage and plant height of pakchoi

2.2 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗活性氧生成的影响

由图1可知,随着[C3mim]BF4浓度的增加,小白菜叶片超氧阴离子自由基()产生速率逐渐升高,500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组产生速率最高,较CK 高17.59%。除200、300 mg·L-1[C3mim]BF4处理组间产生速率无显著差异外,其他各处理间均差异显著。

图1 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗O2-产生速率的影响Fig.1 Effects of the concentration of[C3mim]BF4on the rate of O2-production in pakchoi seedlings

由图2可知,随着[C3mim]BF4浓度的增加,小白菜幼苗H2O2含量也逐渐升高,500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组H2O2含量最高。100 mg·L-1[C3mim]BF4处理组 H2O2含量显著低于 CK；200、300 mg·L-1[C3mim]BF4处理组H2O2含量与CK间无显著差异；而 400、500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组 H2O2含量显著高于CK,其中500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组H2O2含量为CK的128%。结果表明,[C3mim]BF4能诱发小白菜幼苗细胞内活性氧的生成,而活性氧代谢失调最终将造成细胞结构的损伤。

2.3 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗MDA含量的影响

MDA是脂质过氧化的最终产物。由图3可知,100～300 mg·L-1[C3mim]BF4处理对小白菜叶片MDA含量无显著影响,继续增加[C3mim]BF4浓度,MDA含量显著升高,400和500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组幼苗MDA含量分别是CK的233%和255%。结果表明,[C3mim]BF4浓度高于400 mg·L-1时能加速小白菜幼苗脂质过氧化进程。

2.4 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗脯氨酸含量的影响

图2 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗H2O2含量的影响Fig.2 Effect of the concentration of[C3mim]BF4on H2O2content in pakchoi seedlings

图3 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗MDA含量的影响Fig.3 Effect of the concentration of[C3mim]BF4on MDAcontent in pakchoi seedlings

脯氨酸是最有效的渗透调节物质之一,以游离态广泛分布在植物细胞中；在多种逆境下,植物体内积累脯氨酸。由图4可知,100～500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组小白菜叶片的脯氨酸含量较CK显著升高,其中,500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组脯氨酸含量最高,是 CK 的 1.67倍。除200、300 mg·L-1[C3mim]BF4处理组间脯氨酸含量无显著差异外,其他各处理间均存在显著差异,且随着[C3mim]BF4浓度的增加,脯氨酸含量呈逐渐升高的趋势。综上表明,离子液体[C3mim]BF4对小白菜细胞构成了胁迫。

2.5 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗抗氧化酶活性的影响

图4 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗脯氨酸含量的影响Fig.4 Effects of the concentration of[C3mim]BF4 on proline content in pakchoi seedlings

由表3可知,100～500 mg·L-1[C3mim]BF4处理下,小白菜叶片的SOD、CAT、APX和GR活性均呈先上升后下降的趋势。300 mg·L-1[C3mim]BF4处理组小白菜叶片的SOD活性最高,较500和100 mg·L-1[C3mim]BF4处理组分别高21.13%、11.09%。各处理组的 SOD活性均显著低于 CK,其中 500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组仅为 CK的77.03%,说明[C3mim]BF4处理抑制了小白菜叶片的SOD活性。300 mg·L-1[C3mim]BF4处理组CAT活性最高,是CK的2.45倍；当[C3mim]BF4浓度为 400 mg·L-1时,小白菜叶片组织中CAT活性下降；当[C3mim]BF4浓度为500 mg·L-1时,CAT活性受到抑制,为 CK的36.69%。300 mg·L-1[C3mim]BF4处理组APX活性最高,是CK的1.98倍,是500 mg·L-1[C3mim]BF4处理组的8.32倍。100 mg·L-1[C3mim]BF4处理组小白菜叶片中APX活性与CK无显著差异；200、300 mg·L-1[C3mim]BF4处理组APX活性较CK显著增加,表明此时APX被激活,然而[C3mim]BF4浓度为400～500 mg·L-1时,APX 活性又显著低于 CK。 400 mg·L-1[C3mim]BF4处理组小白菜叶的GR活性最高,为CK的7.48倍。各处理组的GR活性均显著高于CK,且各处理间差异显著。

2.6 [C3mim]BF4对抗氧化酶基因表达的影响

由图5、表 4可知,400 mg·L-1[C3mim]BF4处理小白菜 1、3、6、12、24 h 和 13 d 后,随着处理时间的延长,Cu/Zn-SOD表达量呈先升高再下降趋势,表达量最高点出现在处理1 h时,其表达量是对照(以0 h为对照)的107.37%,随后表达量逐渐下调,但是在处理3 h时仍然高于对照,是对照的102.79%。处理6 h时,Cu/Zn-SOD表达量已经低于对照；处理13 d时,基因表达量仅为对照的64.54%。表明离子液体的长时间处理会导致Cu/Zn-SOD表达量降低,且处理时间越长对Cu/Zn-SOD表达量的抑制作用越强。

表3 [C3mim]BF4浓度对小白菜幼苗抗氧化酶系的影响Table 3 Effect of the concentration of[C3mim]BF4on antioxidant enzyme series in pakchoi seedlings

400 mg·L-1[C3mim]BF4对CAT和APX表达的影响与Cu/Zn-SOD相似,随着处理时间的延长,CAT和APX基因表达量均呈先升高再下降的趋势,且处理时间越长对抗氧化酶基因表达的抑制作用越强。不同在于,CAT和APX表达最高点出现在处理3 h,此时CAT和APX表达量分别是对照的125.74%和105.39%。处理6 h时,APX表达量已经低于对照；而处理6、12 h时CAT表达量仍高于对照。处理13 d时,其CAT和APX表达量均显著低于对照,分别为对照的75.00%和16.16%。比较[C3mim]BF4对3种抗氧化酶基因表达的影响可知,[C3mim]BF4对APX基因表达的抑制作用更强。

表4 离子液体[C3mim]BF4处理时间对小白菜叶片抗氧化酶基因表达的影响(灰度值)Table 4 Effect of[C3mim]BF4treatment time on gene expression of antioxidant enzymes in leaves of pakchoi seedlings(grayscale value)

3 讨论

图5 [C3mim]BF4处理时间对小白菜叶片抗氧化酶基因表达的影响Fig.5 Effect of[C3mim]BF4treatment time on gene expression of antioxidant enzymes in leaves of pakchoi seedlings

幼苗期是植物对外界环境因素最敏感的时期,离子液体对幼苗生长有抑制作用。由于离子液体的不同及植物材料的不同,抑制作用的起始浓度及各浓度下的抑制率存在较大差异[16-18]。本研究中,100～400 mg·L-1[C3mim]BF4对小白菜幼苗生长无显著影响,而500 mg·L-1[C3mim]BF4抑制幼苗生长。杨芬芬等[19]研究发现100～1 000 mg·L-1浓度范围内离子液体丁基甲基咪唑氯([BMIM]C1)、丁基甲基咪唑溴[EMIM]Br、1,3二甲基咪唑磷酸二甲酯盐([MMIM][DMP])和乙基甲基咪唑硫酸单乙酯盐([EMIM][Es])对小白菜的发芽率和发芽势均未产生明显影响,这与本研究结果不同。本研究中,浓度高于400 mg·L-1的[C3mim]BF4对小白菜种子发芽率产生了抑制。这可能与不同类型的离子液体毒性不同有关。

植物在正常生长状态下,体内可以产生适量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),且ROS的产生和消除处于一种动态平衡,即植物体内自身可以清除ROS。但当植物遭遇干旱、冷冻、盐碱等不良环境时,体内ROS产生和消除的动态平衡会被破坏,进而导致生物体内ROS的过量积累[20],对植物的生长发育产生影响[21-23],如对生物大分子的破坏及生物膜的过氧化等,甚至造成细胞功能发生障碍而死亡[24]。抗氧化酶系统在植物ROS清除过程中发挥着重要作用,其中SOD 催化转化为 H2O2和O2；CAT催化H2O2分解为H2O和O2；APX是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分,也是清除H2O2(特别是叶绿体中的 H2O2)的关键酶,还是抗坏血酸代谢的主要酶类。本试验中,不同浓度的[C3mim]BF4处理使小白菜叶片产生速率和H2O2含量显著升高,且与离子浓度呈正相关,表明[C3mim]BF4作为一种刺激物引发了活性氧的生成。小白菜叶片CAT和APX活性均呈先升高后降低的趋势,说明较低浓度的[C3mim]BF4对抗氧化酶生成有一定的促进作用。高浓度(500 mg·L-1)[C3mim]BF4处理显著抑制了小白菜叶片SOD、CAT和APX活性,这与500 mg·L-1[C3mim]BF4抑制小白菜生长,促进和H2O2的产生相对应,但与前人在小麦[25]、大麦[26]、蚕豆[27]、玉米[5]上的研究结果不完全相同。这不仅与植物材料对离子液体的敏感程度有关,还与离子液体的毒性相关。GR作为调节谷胱甘肽代谢的关键酶,其抗氧化胁迫作用体现在通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环使植物体内2种重要的非酶抗氧化剂-谷胱甘肽和抗坏血酸得以再生[28]。离子液体[C3mim]BF4使小白菜叶片GR活性显著升高,均高于CK。本研究中几种抗氧化酶对[C3mim]BF4的响应幅度及趋势不同,表明不同抗氧化酶对[C3mim]BF4的敏感性不同,SOD对[C3mim]BF4的应激敏感性高于CAT、APX和GR。此外,SOD、APX和CAT活性与其基因表达量之间存在不同步的现象,特别是CAT活性与其基因,这可能是因为本研究仅检测了Cu/Zn-SOD、CAT1、APX1的表达情况,而它们的表达产物只是 SOD、APX和CAT同工酶中的一种,不能代表全酶系。本研究还发现400 mg·L-1[C3mim]BF4处理超过3 h会降低Cu/Zn-SOD和APX基因表达量,且随着处理时间的延长,[C3mim]BF4对抗氧化酶的抑制作用越明显,这与400 mg·L-1[C3mim]BF4对SOD和APX活性的抑制效果一致。

MDA是膜质过氧化的产物,细胞中MDA含量可反映细胞内脂质过氧化的程度,进而反映细胞受损的程度,其产生量已成为鉴别细胞伤害的指标之一。本研究中,100～300 mg·L-1[C3mim]BF4对叶片MDA含量无显著影响；当[C3mim]BF4浓度高于400 mg·L-1时小白菜叶片MDA含量显著升高。综合考虑[C3mim]BF4对叶片活性氧和抗氧化酶的影响,发现在100～300 mg·L-1[C3mim]BF4处理下,小白菜细胞内ROS浓度和抗氧化酶含量同时增加,抗氧化酶及时淬灭了离子液体诱发的ROS,保护了脂质和细胞结构的完整性；而较高浓度的[C3mim]BF4破坏了植物体内的ROS代谢平衡,抗氧酶及非酶抗氧化物无法清除细胞内的ROS,导致膜质过氧化程度加重,细胞受到严重损伤。