日喀则市青稞全籽粒抗氧化品质研究

王新坤 刘 超 杨清梅 郭 溆 王月明 邓 鹏 孙金月

(山东省农业科学院农产品研究所/农业部新食品资源加工重点实验室/山东省农产品精深加工技术重点实验室,山东济南 250100)

青稞(Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.),禾本科大麦属,籽粒裸露,又称裸大麦,具备“三高两低”(蛋白质、膳食纤维、维生素含量高；脂肪、糖含量低)的营养特征,是青藏高原最具优势的粮食作物之一。近年来青稞因富含具有保健和药用价值的生物活性成分如β-葡聚糖、花色苷等,已成为降血糖、抗氧化等功能食品开发的明星原料。随着年龄增长,人体清除自由基能力会下降,而抗自由基和活性氧系统的功能则与年龄增长呈负相关,很难长期保持最佳平衡状态[1]。另外,有害的环境因素、不健康的饮食生活方式和病理因素均会加速自由基和活性氧的生成[2]。大量生成的自由基和活性氧会直接氧化损伤人体各部位的脂质、核酸和蛋白质等生物大分子,诱发多种慢性疾病,如心脑血管病、动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病等[3]。

常见的抗氧化剂包括以下几类,以维生素E、维生素C、类胡萝卜素、辅酶等为主的维生素类；谷胱甘肽和转铁蛋白、金属硫蛋白等含金属蛋白；硒、铜、锌、锰等矿质元素；植物化学物质如多糖、甾醇、多酚、萝卜硫素、萜类化合物、色素等[4]。大麦是酚类物质种类和含量较多的谷物之一,其酚类物质多存在于麦皮、糊粉层、胚乳以及贮藏蛋白中,具有较强的抗氧化活性。青稞酚类组成不同于普通大麦,已有抗氧化研究多针对大麦展开,有关青稞抗氧化品质综合评价的研究更是少见。因此有必要从不同粒色及品种差异性的角度,全面比较和评价青稞全籽粒抗氧化品质。

本研究以青稞全籽粒为研究对象,探究13个青稞品种籽粒的花色苷、原花青素、总黄酮和总酚对抗氧化品质的影响,采用相关性分析、主成分分析及聚类分析方法,筛选出抗氧化品质最优的青稞品种,同时确定评价青稞抗氧化品质的主要因素,以期为青稞抗氧化类保健食品开发提供理论依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试青稞材料共计13份,其中地方品种9份、育成品种(系)4份,均来自西藏日喀则地区,品种名称见图1。将青稞籽粒清洗后经50℃烘箱干燥12 h,然后粉碎过60目筛,置于-20℃冰箱中待用。

原花青素标准品、没食子酸(gallic acid equivalent,GAE)标准品、芦丁标准品、矢车菊色素3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)标准品、荧光素钠、2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐[2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH]、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸[(S)-(-)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox]、1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、菲咯嗪等稀有试剂均购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1750型紫外分光光度计,日本岛津公司；Lab-1A-50E型冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司；CR22GIII型高速台式冷冻离心机,日本日立公司；RE-2000E型旋转蒸发器,巩义市予华仪器有限责任公司；A11型研磨粉碎机,德国艾卡公司；MS型电子天平,瑞士梅特勒托利多公司；SYNERGY HTX型酶标仪,美国伯腾仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 花色苷含量测定 参考Zhu等[5]的方法并稍作修改。取1 g青稞粉溶解于20 mL乙醇溶液(pH值3.0,质量分数 60%)中,混匀,在 40℃条件下 120 r·min-1震荡提取 1 h,将混合液在 12 000 r·min-1下离心15 min。取2份1 mL上清液,分别用氯化钾缓冲液(pH值1.0)和醋酸钠缓冲液(pH值4.5)定容至5 mL,静置1 h后分别测定2份溶液在515 nm和700 nm波长处的吸光度值并计算吸光度变化。按照公式计算样品中花色苷含量:

式中,A1.0、A4.5分别表示加pH值1.0缓冲液和pH值4.5缓冲液的样液在510 nm和700 nm波长处的吸光度值；MW为C3G的相对分子质量,449.2；ε为C3G的消光系数,26 900；C为缓冲液的浓度。

1.3.2 原花青素含量测定 参考Himmer等[6]的方法。称取1 g青稞粉,加入25 mL纯甲醇摇匀,120 r·min-1避光震荡提取1 h,将混合液于12 000 r·min-1离心15 min后取上清液待用。取1 mL样液,先加入3 mL 4%香草醛甲醇溶液混匀,然后加入1.5 mL浓盐酸,再次混匀。室温静置10 min,在500 nm波长处测定吸光度值,根据标准曲线求得样品中原花青素含量。

1.3.3 总黄酮含量测定 参考He等[7]的方法并稍作改进。称取5 g青稞粉,加入100 mL 50%乙醇溶液,在40℃条件下120 r·min-1震荡提取2 h,将混合液12 000 r min-1离心15 min后取上清。将收集到的上清液减压浓缩至10 mL左右。取1 mL黄酮浓缩液,加1 mL 5%的亚硝酸钠溶液,振摇后静置5 min,加入2 mL 10%硝酸铝溶液,摇匀后静置 1 h,加入2 mL 1 mol·L-1氢氧化钠溶液,用30%乙醇定容至10 mL,以未加硝酸铝的试管调零,摇匀后在510 nm波长处测定吸光度值,以芦丁为标准品制作标准曲线,根据回归方程计算样品中总黄酮含量。

1.3.4 总酚含量测定 青稞全籽粒总酚含量分析包括提取和测定2个步骤。取2 g青稞粉,加入20 mL预冷的体积分数为80%的丙酮溶液,混匀,在通氮气条件下120 r·min-1震荡提取1 h,将混合液于12 000 r·min-1离心15min,留上清。收集残渣并重复上述步骤2次,合并上清液,45℃下减压浓缩至干,用超纯水溶解馏分,即得游离酚提取液。用2 mol·L-1氢氧化钠溶液消化制备游离酚后剩余的青稞粉残渣1 h,用2 mol·L-1盐酸中和消解后的氢氧化钠。用正己烷对消解后溶液进行脱脂处理3次,以减少脂肪对后续提取步骤的干扰。用20 mL乙酸乙酯萃取消解且脱脂后的溶液,在通氮气的条件下120 r·min-1震荡提取1 h后,将混合液12 000 r·min-1离心15 min取上清。回收残渣并重复上述步骤5次,合并上清液,45℃下减压浓缩至干,用超纯水溶解馏分,即得结合酚提取液。

游离酚和结合酚提取液中酚含量的测定采用福林酚法[8]。吸取样品提取液100 μL于试管中,加入400 μL蒸馏水和100 μL福林酚试剂,摇匀后反应6 min；加入1 mL 7%碳酸钠溶液,再加入1 mL超纯水,摇匀后避光静置90 min,在760 nm波长处测其吸光度。根据没食子酸对照品建立的标准曲线计算样品中游离酚和结合酚含量,两项相加即为总酚含量。

1.3.5 氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorption capacity,ORAC)值测定 参考Wolfe等[9]的方法并加以改进。准确称取1 g青稞粉,加入25 mL预冷的乙酸乙酯,常温下避光震荡提取1 h,采用Whatman滤浓纸过滤后收集滤液,滤渣经相同步骤提取2次。合并滤液于35℃减压蒸干。然后用80%乙醇溶液重新溶解,得样品粗提液。将粗提液和Trolox用75 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值7.4)稀释至适当浓度。取20 μL样品或Trolox标准物溶液加至96孔荧光酶标板中,然后加入20 μL 75 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值7.4)和20 μL 70 nmol·L-1荧光素钠盐溶液,37℃孵育20 min,加入140 μL 12 mmol·L-1AAPH溶液启动反应,以激发波长485±20 nm,发射波长530±20 nm进行连续荧光强度扫描,每2 min测定一次[10],测定时间设定在荧光衰减呈基线后为止,样品的ORAC值通过标准物Trolox建立的标准曲线计算,结果表示为 μmol TE Trolox Equivalents,当量)g-1DW。

1.3.6 自由基清除能力测定 参考Liang等[11]的方法。取1 mL 1.3.5中的样品粗提液于试管中,再加入5 mL 0.1 mmol·L-1DPPH乙醇溶液,摇匀后室温下避光反应20 min。设置对照,在517 nm波长处测吸光度值。按照公式计算DPPH自由基清除能力:

1.3.7 铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)测定 参考Benzie等[12]的方法并略加修改。取1 mL 1.3.5中的样品粗提液于试管中,加3 mL FRAP工作液,充分摇匀后37℃水浴避光反应30 min,以甲醇代替样品提取液为空白调零,在593 nm波长处测定吸光度值。以Trolox作为对照品绘制标准曲线,根据标准曲线计算出样品铁离子还原能力,FRAP值以TE 100 g-1DW表示。

1.3.8 金属离子螯合能力(metal ion chelating capacity,MCC)测定 按照Decker等[13]的方法。移取1.3.5中的样品粗提液1 mL,依次加入3.7 mL甲醇、0.1 mL 2 mmol·L-1FeCl2·4H2O 溶液、0.2 mL 2.5 mmol·L-1菲咯嗪溶液。反应体系在暗中静置10 min,最后在562 nm波长处测定各组样品吸光度值。以未加样品组作为空白对照。按照公式计算金属离子螯合能力:

1.4 统计方法

试验中每个处理均重复3次,数据以均值±标准差的形式表示。多重比较(采用Duncan式方法,定义P＜0.05为差异显著)、相关分析(相关系数概率P＜0.05为显著相关)、主成分分析和聚类分析均通过SAS 9.4统计软件运行完成。采用Sigmaplot 12.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 青稞品种产地分布及籽粒外观特征

13个青稞品种中有4个属于推广种植品种,即藏青320[14]、藏青2000[15]、喜拉19和喜拉22,这4个品种全部收集于日喀则市桑株孜区,其余9个品种均为地方品种,分布于萨迦等7个县,其中萨迦、康马两县均有2个品种,且分布于不同的2个乡镇(图1-A)。8个区县共覆盖日喀则市57.82%的面积(图1-B)。13个青稞品种的海拔梯度区间是3 800～4 300 m,藏青320和藏青2000为西藏全区适应品种,另外11个品种较均匀地分布在9个不同的海拔高度上,籽粒颜色较深的品种所在海拔高度高于籽粒颜色较浅品种,其中所在海拔位置最高的品种是雄樟,所处海拔高度为4 450 m(图1-C)。13个青稞品种的籽粒颜色深浅各不相同,但可将其划分为棕、紫和黑三色(图1-D)。

2.2 青稞籽粒中酚类物质结果分析

花色苷是一种黄酮类水溶性色素,主要存在于青稞表皮中,由花青素与糖以糖苷键结合而成,赋予青稞籽粒颜色。由图2-A可知,黑色品种萨贵、曲加、雄樟和紫色品种卡娃夏沐溪中花色苷含量较高,均高于40 mg C3G 100 g-1DW,其中雄樟中花色苷含量最高,为102.38 mg C3G 100g-1DW。原花青素是植物中广泛存在的聚多酚类混合物,其氧化去除自由基的能力强于花青素,其抗氧化效果约为维生素E的50倍,维生素C的20倍[16]。由图2-B可知,原花青素含量较高的3个品种分别为:黑色品种雄樟以及紫色品种卡娃夏沐溪和喜珠,其中雄樟中原花青素含量最高,为142.42 mg·100g-1DW。黄酮是一类重要的酚类化合物,日常膳食摄入的酚类化合物中黄酮占据了很大的比例[17]。由图2-C可知,总黄酮含量最高的品种为黑色品种雄樟,为478.12 mg Rutin 100 g-1DW,其次为紫色品种卡娃夏沐溪、优喜、喜珠以及黑色品种萨贵和曲加,且上述5个品种间无显著差异。由图2-E、D、F可知,青稞籽粒中游离酚、结合酚和总酚含量在不同品种中分布规律各异,游离酚和总酚含量最高的是黑色品种雄樟,其次是紫色品种喜珠,棕色品种中游离酚和总酚含量均较低；青稞籽粒结合酚含量低于游离酚含量,且其变化规律不同于游离酚,棕色品种藏青2000、紫色品种卡娃夏沐溪和曲堆嘎木及黑色品种曲加结合酚含量较高。

2.3 青稞籽粒的抗氧化能力分析

图1 青稞品种在日喀则地区分布及籽粒外观特征Fig.1 Distribution of highland barley varieties and seeds appearance in Rikaze area

选择ORAC法、DPPH法、FRAP法和MCC法同时对13个青稞品种籽粒的抗氧化能力进行测定。由图3-A可知,3个黑色品种中雄樟和曲加的ORAC较高,分别为 117.39 μmol TE g-1DW 和 103.89 μmol TE g-1DW；5个紫色品种的ORAC均显著低于上述2个黑色品种(P＜0.05)；棕色品种的ORAC较低,且品种间差异不显著。由图3-B可知,DPPH自由基清除能力较强的是3个黑色品种和紫色品种喜珠和嘎如,棕色品种中藏青320、噶木果日和喜拉19的DPPH自由基清除能力最低。由图3-C可知,FRAP最强的是黑色品种雄樟,其值高达4 523.43 mg TE 100g-1DW,另2个黑色品种萨贵和曲加与5个紫色品种间的差异均不显著,棕色品种藏青 2000的 FRAP最弱,其值为1 220.60 mg TE 100g-1DW。由图3-D可知,从CC最强的是紫色品种曲堆嘎木,其值为43.81%,最低的是棕色品种藏青2000,值为25.62%,其余11个品种间均无显著差异。

2.4 酚类物质与抗氧化能力间的相关分析

由表1可知,青稞籽粒的抗氧化指标与酚类物质含量之间存在紧密的相关性,ORAC、DPPH自由基清除能力和FRAP与花色苷、原花青素、总黄酮、游离酚和总酚含量均呈极显著正相关(P＜0.01),但与结合酚含量均无显著相关性(P＞0.05)。MCC与花色苷等6种酚类物质含量均无相关性,但其与ORAC及FRAP均呈显著正相关(P＜0.05)。

2.5 青稞籽粒抗氧化品质的主成分分析

对13个青稞品种的花色苷、原花青素、总黄酮、游离酚、结合酚和总酚6种酚类物质含量以及ORAC、DPPH自由基清除能力、FRAP和MCC 4项抗氧化品质指标进行主成分分析。图4-A为特征根值的陡坡图,Prin1、Prin2和Prin3 3个主成分的特征根值下降幅度最大。提取的3个主成分代表全部10项考察指标87.43%的品质变异(图4-B)。由表2可知,花色苷、原花青素、总黄酮、游离酚、总酚5种抗氧化组分指标和ORAC、DPPH自由基清除能力、FRAP、MCC 4项抗氧化能力指标的特征向量对Prin1均产生正向效应,只有结合酚对Prin1产生负向效应,因此,可以将Prin1概括为游离酚因子。Prin2的贡献率是15.4%(图4-B),花色苷、原花青素、总黄酮、游离酚、结合酚和总酚6种抗氧化组分指标的特征向量对Prin2均产生正向效应,而ORAC、DPPH自由基清除能、FRAP和MCC 4项抗氧化能力指标的特征向量对Prin2均产生负向效应,因此可以将Prin2概括为多酚因子；Prin3的贡献率是9.75%(图4-B),结合酚和总酚2种抗氧化组分指标以及ORAC、DPPH自由基清除能力和MCC 3项抗氧化能力指标的特征向量对Prin3均产生正向效应,因此可以将Prin3概括为结合酚因子。基于3个主成分计算13个品种各自的综合主成分得分能较直观地判断某一品种的抗氧化品质优劣(图4-C),综合主成分分值越高,抗氧化品质表现越好。黑色品种雄樟、曲加、萨贵和紫色品种卡娃夏沐溪、喜珠综合主成分得分较高,且均为正值,其余8个青稞品种主成分得分均为负值,抗氧化品质相对较差。

图2 青稞籽粒中主要酚类物质Fig.2 Major phenolics in highland barley grains

图3 青稞籽粒抗氧化能力Fig.3 Antioxidant capacity of highland barley grains

2.6 聚类分析

由图5可知,聚类之间的平均距离大致为0.9时可将所有品种分为3个类群:第Ⅰ类群包括5个品种,占供试品种总数的38.46%,该类群材料籽粒颜色全部为棕色；第Ⅱ类群包括7个品种,占供试品种总数的53.85%,该类群材料表现为紫色(5份)和黑色(2份)；第Ⅲ类群包括1个品种,即雄樟,籽粒颜色为黑色。

3 讨论

国内外对青稞籽粒颜色的划分目前并无统一标准,主要分为黄(棕)、蓝、紫(红)和黑4种颜色[18],从日喀则市收集的13个青稞品种籽粒颜色皆在其列。众所周知,全谷物在一定程度上有助于缓解氧化应激相关的心血管疾病、癌症和糖尿病等慢性病,而谷物酚被认为是全谷物发挥作用的主要物质基础[19]。青稞籽粒中花色苷、原花青素、总黄酮和总酚含量的多重比较结果显示,紫色和黑色品种中酚含量较高,13个品种中4种酚类物质指标的最高值对应的品种均为雄樟；另外,海拔较高处的品种颜色较深且酚类物质含量一般较高,这可能与品种或生长环境有关。籽粒颜色对青稞中酚类物质的含量影响较大,黑色青稞中含有更为丰富的酚类化合物。有研究仅选择总酚、总黄酮含量以及DPPH自由基清除能力、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]自由基清除能力及FRAP 5项指标评价不同粒色青稞种质资源体外抗氧化能力,得出相似结论,即黑色青稞的多酚含量及抗氧化活性普遍较高于黄色青稞[20]。黑色食品如黑豆、黑小麦、黑芝麻一直深受人们的青睐,体外抗氧化研究表明青稞色素对自由基清除能力高于黑大豆等其他物种中的天然色素[21]。有报道称植物籽粒中所含营养成分的高低与其颜色的深浅有着紧密的关系,颜色越深,其营养结构越丰富合理[22]。可见青稞具有开发抗氧化功能食品的价值。

表1 酚类物质与抗氧化指标间的相关分析Table 1 Correlation analysis between phenolics and antioxidant index

表2 主成分特征向量Table 2 Principal component eigenvector

图4 青稞籽粒抗氧化能力主成分分析及综合评价Fig.4 Principal component analysis and comprehensive evaluation of the antioxidant capacity of barley grains

图5 使用类平均法的谱系聚类图Fig.5 Cluster analysis by unweighted pair-group method with arithmetic mean

已有报道表明,大麦具有较强的还原力和金属离子螯合能力,可清除自由基、抑制亚油酸自动氧化和生物膜脂质过氧化作用。但由于不同抗氧化剂的抗氧化机理不同,因此在不同的反应体系中抗氧化能力有所差异,用单一或单一抗氧化原理的指标来评价物质的抗氧化活性存在较大的片面性。本研究抗氧化活性评价结果表明,紫色和黑色品种中ORAC、DPPH自由基清除能力、FRAP数值均高于棕色品种,这与抗氧化组分含量不同有关,紫色和黑色品种中酚类物质含量更高。相比之下,MCC在品种间的变化规律与以上3个指标不同,不同籽粒颜色的品种间大多差异不显著。MCC测定的基本原理是:抗氧化剂被认为具有鳌合金属离子的能力,从而避免发生芬顿反应产生自由基[5]。青稞籽粒中富含植酸,相比酚类物质,植酸对金属离子螯合能力更强,可能因此造成酚类物质与MCC间相关关系不显著。单一的酚类物质所提供的抗氧化能力不能替代青稞籽粒中的植物化学物整体,青稞的抗氧化功能可能是籽粒中所含植物化学物质协同、叠加等作用的结果[23]。因此,在了解全谷物青稞酚类物质活性的基础上,弄清酚类物质及其抗氧化能力之间的相互作用,对进一步掌握全谷物青稞的抗氧化功能具有重要意义。近年来,已成功研制出青稞挂面、青稞速食面、青稞营养粉、萌动青稞绿茶等产品,这些产品的加工过程涉及高温、高压、发芽等工艺,势必会对青稞中的酚类物质产生影响,但是关于不同加工方式对青稞抗氧化组分和抗氧化能力的研究却少有报道。下一步应重点研究青稞在加工过程中的抗氧化品质评价,筛选更适合用于加工的青稞品种。

青稞全谷物籽粒中酚类物质成分种类复杂,其所含的多糖、植酸、维生素E也有抗氧化作用,对青稞籽粒抗氧化作用同样有贡献[24]。为筛选青稞籽粒抗氧化品质最真实相关的指标,对相关数据进行了主成分分析,其结果进一步印证了籽粒颜色对青稞抗氧化品质的贡献,深颜色尤其是黑色品种的抗氧化品质更为优秀。当人体氧化-还原环境稳态失衡时,体内自由基不能被及时清除,通过食用富含花色苷、黄酮等天然抗氧化物质的食物,可以清除过多的自由基,维持机体内环境的动态平衡,黑色品种雄樟的酚类物质含量高,抗氧化能力卓越,适宜开发抗氧功能的保健食品。聚类分析结果与主成分分析结果对应,具有较好的一致性,抗氧化能力相近的品种被聚为同一类群,也印证了通过籽粒颜色进行青稞抗氧化品质初筛的可行性。

中国青藏高原是世界上海拔最高的高原,被誉为地球的“第三极”,以低氧、强辐射、气温低等著称[25-26]。一方面青稞长期生长在高紫外线辐射条件下,其可能会诱导产生更多适应这种高辐射环境的植物化学物质,如花色苷等酚类物质,这些色素类物质的沉积使籽粒呈现紫色和黑色为主的深度颜色,以抵御更多的紫外线对细胞的破坏；另一方面经过严酷胁迫环境的选择,只有抗氧化能力更强的品种被保留下来,形成了鲜明独特的高原适应特征。青藏高原生活环境恶劣,医疗资源落后,但糖尿病、心脑血管疾病等慢性疾病发病率很低[27]。究其原因,一方面很可能源自衰老基因的遗传差异[28]；另一方面,藏民以青稞为主食,而且主要以全籽粒轻加工食品的形式摄入。然而深色青稞突出的抗氧化品质是否也对长寿起着“功不可没”的作用尚有待进一步研究。

4 结论

对13个青稞品种的花色苷、原花青素、总黄酮、游离酚、结合酚和总酚进行检测,发现6种抗氧化组分指标在大部分青稞品种中变化各异,除结合酚外的5种酚类物质指标的最高值均出现在雄樟中；除结合酚外的5种酚类物质指标与4种抗氧化指标密切相关；用主成分分析法和聚类分析法对这13种青稞进行了分类分析,提取的3个主成分可反映原变量87.43%的信息,是评价青稞抗氧化组分的特征指标,能够代表总变量的绝大部分信息。通过酚类物质和抗氧化指标间的相关分析理清了两者之间的关系,为青稞酚类物质的利用奠定了基础。聚类分析和主成分分析对品种分类判定结果基本一致。对不同青稞品种进行综合评价及分析的结果,可作为筛选优良品质青稞品种的指标,对利用青稞多酚类成分开发功能食品具有重要的指导意义。