外源硫化氢缓解桑树重金属胁迫的效应分析

高鸿鹏 杜 赓 李文强 董小龙 苏 超 张敏娟*

(1.西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所/ 2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100)

由于过去工业和矿业的长期粗放式发展，土壤重金属污染对农业的严重危害渐渐显现。我国农业土壤受重金属影响已达2 000万公顷，其中镉的危害性位列第一，其次是铅、锌、铜和汞。重金属胁迫下，作物生长发育异常，粮食减产，年经济损失达200亿元[1]。 镉和砷是矿区土地重金属污染的前两位首要污染物，都具有强烈的毒性，其污染范围广、稳定不可降解，在环境中可长期积累[2-3]。镉和砷被植物吸收之后直接影响了植物的生长和产量，并且，土壤中的镉和砷可以通过食物链进入人体，危害人类健康，所以，植物在重金属胁迫下的损伤与抗性机制研究已成为研究热点。因此，对植物镉、砷胁迫下的生长和发育进行研究，探讨镉、砷毒害对植物生长的影响，能够为预防作物减产和镉、砷中毒提供理论依据。

种子萌发和幼苗生长是植物生命周期的重要阶段，也是对外界环境因子最敏感的时期之一，因而种子萌发和苗期生长指标常用来评价植物的重金属耐性[4-8]。种子萌发是植物生长发育的基础，也是植物最早感受重金属胁迫的阶段，了解种子萌发对逆境胁迫的反应，是系统认识逆境伤害机理的较好途径。桑树作为具有重要修复潜力的木本植物，其在重金属污染土壤修复方面的可行性已被研究证实[9-13]。研究发现，在重金属污染地区，种子受重金属胁迫伤害，会造成发芽率降低，生长缓慢，根部发育不良等现象。而有关外源物质缓解重金属镉或砷胁迫对桑树种子萌发的伤害研究尚未见报道。

硫化氢是重要的气体信号分子，能够缓解非生物胁迫对植物的伤害作用，对于植物抵抗逆境胁迫非常重要[14-15]。本研究拟利用硫化氢的供体硫氢化钠溶液浸种处理，探讨外源施加硫化氢是否能够缓解重金属镉或砷对于桑树种子萌发及生长的胁迫作用，为阐明镉、砷胁迫下的植物损伤与抗性机制提供理论依据，同时为缓解镉、砷对植物的毒害作用进而提高植物的产量和品质奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以桑树品种丰驰桑的种子为材料，桑种采集于上一年四月到五月，4 ℃保存。重金属镉和砷的供体为无水氯化镉(CdCl2)和无水亚砷酸钠(NaASO2)，以上试剂购自Aladdin公司。H2S供体为硫氢化钠(NaHS)购自Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒

将种子清洗干净，加入适量水，种子吸水12 h进行活化。将吸胀的种子置于超净工作台上，以70%酒精消毒5 min，次氯酸钠溶液(有效氯含量不低于1%)消毒30 min，无菌水漂洗，无菌种子置于无菌滤纸上静置吹干，至表面无明显水渍时，用于下一步试验。

1.2.2 萌发试验

采用琼脂平板作为发芽床进行萌发试验，重金属处理包括镉处理和砷处理，分别以种子发芽抑制率大于50%的重金属浓度作为处理浓度，其中，镉浓度设置为0.15 mmol/L，砷浓度设置为38 mmol/L，向各组重金属处理液中加入7 g/L琼脂，高温高压灭菌后制备琼脂平板，空白对照组(CK)用蒸馏水制备琼脂平板。

1.2.3 硫氢化钠浸种处理

设置硫氢化钠浓度为0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L, 1.5 mmol/L，室温浸种12 h。将消毒后的种子整齐排列在上述平板上，每皿30粒种子，每个处理设置3组重复，培养皿于23 ℃恒温培养室暗培养。

1. 3 数据统计及分析

以芽长与种子长度相等即认为发芽，每天定时对每个培养皿发芽种子数进行统计。用游标卡尺测量发芽种子的芽长和根长。计算种子发芽率、发芽势、发芽指数、(平均)种苗生长量和种子活力指数。发芽率为最终发芽数与供试种子数比值。发芽势为发芽高峰期发芽种子数与供试数比值，取开始发芽的4 d为标准。计算公式如下：

发芽指数：

式中Gt为发芽种子粒数，Dt为相应的发芽日数，即(当天发芽数/发芽日数)的累加。

种子活力指数：

式中S即种苗生长量，为种苗的全长。

用Excel和SPSS软件处理数据，计算3次重复的“平均值±标准差”，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s方法比较不同数据组间的差异，显著性水平设置为0.05。

图1 硫化氢对镉胁迫下桑树种子萌发指标的影响注：镉处理浓度为0.15 mmol/L，硫氢化钠浓度为0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小写字母表示处理之间具有显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 外源硫化氢对镉胁迫下桑树种子萌发及幼苗生长的影响

如图1所示，0.15 mmol/L镉胁迫下桑树种子发芽率、发芽势、发芽指数急剧下降，其中发芽率降低了41.1%，发芽势降低了63.3%。硫氢化钠浸种处理缓解了镉胁迫对种子萌发的抑制，种子平均发芽率、发芽势、发芽指数升高。0.3 mmol/L硫氢化钠浸种处理发芽率升高不显著，0.9 mmol/L和1.5 mmol/L硫氢化钠处理组发芽率、发芽势、发芽指数显著升高，其中，1.5 mmol/L硫氢化钠处理组发芽率、发芽势、发芽指数分别升高了28.9%，46.7%和10.3。与空白对照相比，1.5 mmol/L硫氢化钠浸种后镉胁迫处理，种子发芽率和发芽指数分别降低了12.2%和16.7%，没有显著性差异，说明1.5 mmol/L硫氢化钠浸种缓解了0.15 mmol/L镉胁迫对种子萌发的抑制作用。

从种苗生长量和种子活力指数看(图2)，0.3 mmol/L和0.9 mmol/L硫氢化钠浸种处理后种子活力指数和种苗生长量与0.15 mmol/L镉胁迫处理没有显著差异，1.5 mmol/L硫氢化钠浸种后种子活力指数和种苗生长量显著高于镉胁迫处理种子，而显著低于空白对照种子，说明1.5 mmol/L硫氢化钠浸种处理能够缓解镉胁迫对种子萌发后幼苗生长的抑制作用，但不能使幼苗完全恢复非胁迫下的生长水平。

图2 硫化氢对镉胁迫下种苗生长量以及种子活力指数的影响注：镉处理浓度为0.15 mmol/L，硫氢化钠浓度为0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小写字母表示处理之间具有显著性差异(P<0.05)。

2.2 外源硫化氢对砷胁迫下桑树种子萌发和幼苗生长的影响

如图3所示，38 mmol/L砷胁迫下桑树种子萌发受到显著抑制，发芽率降低了41.1%，发芽势降低了53.3%，发芽指数降低了8.9。1.5 mmol/L硫氢化钠浸种处理能够缓解砷胁迫对种子萌发抑制作用，0.3 mmol/L硫氢化钠浸种处理后种子发芽率、发芽势分别升高了27.8%和35.6%，显著高于砷处理组。0.9 mmol/L和1.5 mmol/L硫氢化钠浸种后，二者之间发芽势、发芽势及发芽指数没有显著差异，但二者的发芽势、发芽势及发芽指数均显著低于空白对照组，发芽率和发芽势比对照分别降低了13.3%和17.8%，表明NaHS处理能够缓解砷对种子萌发的胁迫，且此种效应具有剂量依赖性。

图3 硫化氢对砷胁迫下桑树种子萌发指标的影响注：砷处理浓度为38 mmol/L，硫氢化钠浓度为0 mmol/L，0.3 mmol/L, 0.9 mmol/L,1.5 mmol/L，不同小写字母表示处理之间具有显著性差异(P<0.05)。

活力指数是表示种子活力比较全面的一项指标，它是种子发芽能力和幼苗长势的综合表示，数值高，种子活力大。如图4所示，当NaHS浓度高于0.3 mmol/L时，种苗生长量显著高于砷处理组，当NaHS浓度高于0.9 mmol/L时，种子活力指数显著高于砷处理组。而1.5 mmol/L硫氢化钠浸种后种苗生长量与种子活力指数呈下降趋势，说明硫氢化钠缓解砷胁迫抑制种子萌发和幼苗生长具有剂量依赖性，但此种缓解作用可能存在一个浓度限值。

图4 硫化氢对砷胁迫下种苗生长量以及种子活力指数的影响注：砷处理浓度为38 mmol/L，硫氢化钠浓度为0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小写字母表示处理之间具有显著性差异(P<0.05)。

3 讨 论

种子作为植物的繁殖体，承载着植物所有的遗传信息，种子的萌发与否决定着植株的生命及群落的形成和演替。因此，深入研究桑树种子萌发的抗逆性遗传调控机理并进行高抗种质资源的鉴定，能够为桑树种质的遗传改良和抗逆品种选育奠定理论基础。

硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳后发现的第3个气体信号分子。外源硫化氢可促进植物种子萌发、根的形态建成、延迟衰老以及增强植物抗逆性[14-15]。外源硫化氢的作用浓度因物种、器官以及生长时期而异，其作用方式表现为低浓度促进，高浓度毒害[16-17]。以不同浓度的硫氢化钠处理大豆种子，与对照相比，当硫氢化钠浓度在0～250 mmol/L时，对种子萌发没有显著影响；300 mmol/L硫氢化钠处理能够使大豆种子发芽率从40% 提高到65%；当硫氢化钠浓度在400～700 mmol/L时，种子发芽率开始降低[18]。本研究结果表明，以种子发芽抑制率为50%的镉浓度来胁迫桑树种子，随着硫氢化钠的浓度升高，其对胁迫的缓解作用增强，1.5 mmol/L硫氢化钠浸种后对发芽率、发芽指数、种苗生长量以及种子活力指数的提高与0.3 mmol/L硫氢化钠浸种具有显著性差异；而以种子发芽抑制率为50%的砷浓度来胁迫桑树种子发现，随着硫氢化钠浓度升高，发芽率与发芽指数无显著提高，发芽势显著提高；而种苗生长量和种子活力指数在1.5mmol/L 硫氢化钠处理组表现出下降趋势，体现出低浓度促进，高浓度抑制现象。硫化氢能够缓解多种非生物胁迫处理对植物种子萌发的抑制作用，植物所适应的外源硫化氢的量随物种不同而有差异。培养液中加入0.75 mmol/L H2S可显著促进干旱胁迫下水稻种子萌发，一定程度上缓解PEG对水稻种子萌发的抑制作用[19]。0.3 mmol/L外源硫化氢处理显著提高了水分胁迫条件下玉米种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根长、株高、根系和地上部分鲜重，显著降低了相对伤害率[20]。硫氢化钠浸种处理缓解了重金属镉对小麦种子萌发的胁迫作用，显著增长小麦胚芽，但对小麦种子根的生长无显著影响[21]。本研究结果证实硫化氢能够显著缓解镉、砷胁迫对桑树种子萌发的抑制，但对于解除镉、砷胁迫对萌发后幼苗生长的抑制作用并不显著，而已有研究表明，硫氢化钠喷施叶片或者浸泡根部处理均能缓解重金属胁迫对幼苗生长的抑制作用，因此，硫化氢在何种浓度、何种作用方式下能够缓解镉、砷胁迫对桑树种子萌发后幼苗生长的抑制作用，硫氢化钠浸种对桑树重金属胁迫伤害的缓解能否用于农业生产实践还需新的研究来证实。