狗枣猕猴桃 AkHSP20基因的生物信息学分析

刘 丹， 毕德泷， 陈 鑫， 王立凤

(牡丹江师范学院， 黑龙江 牡丹江 157012)

狗枣猕猴桃﹝Actinidiakolomikta(Maxim. et Rupr.) Maxim.﹞，别名深山木天蓼、狗枣子，猕猴桃属大型落叶藤本植物，分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、四川、云南等地，俄罗斯远东、朝鲜半岛及日本也有分布，其果实柔软多汁、酸甜可口、维生素C含量较高，是一种保健型水果，其叶片随季节会发生动态变化，成绿、白、粉、浅红和紫红的斑状彩叶。狗枣猕猴桃是最为耐寒的猕猴桃品种之一，是良好的抗寒育种资源[1-3]。热激蛋白(heat shock protein，HSP)是真核生物中普遍存在的一类蛋白，在绝大多数植物中起着关键作用。根据其分子量大小可以分为5个家族，HSP100、HSP90、HSP70、HSP60及小分子，小分子HSP普遍约20 kDa，故统称为HSP20[4]。在逆境环境中，HSP能够为稳定细胞结构、辅助蛋白的运输和折叠、维持细胞机能用以提高植物体对胁迫的适应性[5]。PRIETO-DAPENA P[6]等研究发现，HSP超表达能够增强向日葵种子的活性，并能延长种子活性。辣椒中的HSP20可以减轻高温对细胞造成的损害[7]。另外，HSP上调表达可以提高番茄在低温环境中的防御机制[8]。HSP对盐碱、重金属、氧化胁迫、生长发育均具有重要作用[9-10]。因此，以狗枣猕猴桃转录组数据为参考，筛选到AkHSP20的cDNA序列，利用生物信息学方法对其理化性质、疏水性/亲水性、蛋白结构功能域、二级结构、三级结构、蛋白质修饰位点及同源性等方面进行预测和分析，以期为狗枣猕猴桃AkHSP20功能研究提供参考。

1数据来源与方法

1.1材料来源

狗枣猕猴桃AkHSP20的cDNA序列从林木育种实验室获得；中华猕猴桃变种(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS17576.1)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis，XP_009609365.1)、欧洲橄榄(Oleaeuropaeavar.sylvestris，XP_022851870.1)、茶树(Camelliasinensis，XP_028099037.1)、葡萄(Vitisvinifera，XP_002280731.1)、枣(Ziziphusjujuba，XP_015884425.1)、阿拉比卡豆(Coffeaarabica，XP_027084273.1)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii，XP_012443093.1)、蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002516108.1)、长蒴黄麻(Corchorusolitorius，OMO86512.1)、克莱门柚(Citrusclementina，XP_006453035.1)、莴苣(Lactucasativa，XP_023735799.1)、榴莲(Duriozibethinus，XP_022750059.1)、豇豆(Vignaunguiculata，XP_027939165.1)、非洲相思子(Abrusprecatorius，XP_027356922.1)等植物氨基酸序列在NCBI数据库中下载。

1.2方法

狗枣猕猴桃AkHSP20的理化性质用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)进行分析；亲水/疏水性用(https://web.expasy.org/protscale/)进行预测；跨膜结构采用SignalP-4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)进行预测；保守结构域用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)进行在线分析；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)对O-糖基化位点进行预测；采用SOPMA及 PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)对其二级结构及蛋白质修饰位点进行预测；使用在线 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)软件分析三级结构。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得15条不同植物的HSP氨基酸序列信息，Neighbor-joining法构建系统进化树分析亲缘性。

2结果与分析

2.1AkHSP20的理化性质

经对狗枣猕猴桃AkHSP20氨基酸序列进行分析表明，AkHSP20基因编码区(CDS)共编码194个氨基酸，分子量2 1575.40 D，理论等电点为5.44，分子式为C936H1517N271O299S7，总原子数3 030，不稳定指数(instability index, Ⅱ)为45.37，根据其不稳定指数可判定该AkHSP20蛋白为非稳定性蛋白。另外，AkHSP20亲水性(GRAVY)的平均水平为-0.683，进一步说明其为非稳定性蛋白。该蛋白中含量最多的为谷氨酸，占11.3%，其次为甘氨酸和缬氨酸，各占8.8%，含量最少的为组氨酸，为1.0%(图1)。根据亲水/疏水性ProtScale分析预测得出(图2)，该基因蛋白最大值为1.911，最小值为-3.989，氨基酸的负值多且分值大。因此，该蛋白为亲水蛋白。

2.2AkHSP20的信号肽及跨膜结构

该蛋白的跨膜结构结果显示D值为0.114(<0.5)，不存在信号肽及跨膜结构(图3)。

注(Note): Ala，丙氨酸；Arg，精氨酸；Asn，天冬酰胺；Asp，天冬氨酸；Cys，半胱氨酸；Gln，谷氨酰胺；Glu，谷氨酸；Gly，甘氨酸；His，组氨酸；Ile，异亮氨酸；Leu，亮氨酸；Lys，赖氨酸；Met，蛋氨酸；Phe，苯丙氨酸；Pro，脯氨酸；Ser，丝氨酸；Thr，苏氨酸；Trp，色氨酸；Tyr，酪氨酸；Val，缬氨酸；Pyl，吡咯赖氨酸；Sec，硒半胱氨酸。

图1狗枣猕猴桃AkHSP20基因编码蛋白质的氨基酸

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkHSP20 gene

图2AkHSP20蛋白的亲水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkHSP20

注：C 值，原始剪切位点的分值；S 值，信号肽的分值；Y 值，综合剪切位点的分值。

Note: C, the value of the original shear site; S, the value of signal peptide; Y, the value of the integrated shear site.

图3AkHSP20蛋白的信号肽

Fig.3 Signal peptide of AkHSP20

2.3AkHSP20的结构域

经比对后对AkHSP20保守序列及蛋白家族进行预测，AkHSP20是HSP20基因家族的成员( ID 10157978 )，第52～142氨基酸的序列区域为HSP20的保守结构域(图4)。

图4AkHSP20的蛋白保守序列

2.4AkHSP20的二级结构及三级结构

采用SOPMA对AkHSP20的二级结构进行分析预测(图5)，该蛋白二级结构中形成螺旋(Helix)的可能为37.63%，形成延伸链(Strand)可能为21.65%，6.70%可能形成转角(Turn)，34.02%为无规卷曲(Random coil)，无特殊结构。AkHSP20蛋白的三级结构预测(图6)为，该结构主要构件为无规卷曲及螺旋，在第52～142个氨基酸中存在HSP20的保守结构。

图5AkHSP20的二级结构预测

2.5AkHSP20蛋白质的修饰位点

经过NetOGlyc方法预测得到AkHSP20含有6个糖基化位点，分别在第36、155、162、170、179、189氨基酸。采用PredictProtein分析(表1)，AkHSP20含有2个酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylation site)、4个十四烷酰化位点(N-myristoylation site)、1个酪氨酸激酶磷酸化位点(Tyrosine kinase phosphorylation site)、1个蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site)。

图6AkHSP20蛋白的三级结构

表1AkHSP20蛋白的修饰位点

2.6氨基酸序列的同源性

经用NCBI数据库中获得15条不同植物的HSP20氨基酸序列信息与AkHSP20氨基酸序列进行同源性分析表明， AkHSP20与中华猕猴桃原变种亲缘相近，而其他植物亲缘关系较远(图7)。

注(Note)：中华猕猴桃变种(Actinidiachinensisvar.chinensis)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)、欧洲橄榄(Oleaeuropaeavar.sylvestris)、茶树(Camelliasinensis)、葡萄(Vitisvinifera)、枣(Ziziphusjujuba)、阿拉比卡豆(Coffeaarabica)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、蓖麻(Ricinuscommunis)、长蒴黄麻(Corchorusolitorius)、克莱门柚(Citrusclementina)、莴苣(Lactucasativa)、榴莲(Duriozibethinus)、豇豆(Vignaunguiculata)、 非洲相思子(Abrusprecatorius)。

图7HSP的系统进化树

Fig.7 HSP system phylogenetic tree

3结论与讨论

HSP在植物的生长发育、逆境胁迫等生理生化过程中起着直接或间接的关键作用。目前，大豆、辣椒、向日葵、茶树、番茄中的HSP基因已经被克隆，并在植物的抗逆中发挥重要作用。通过狗枣猕猴桃转录组数据，筛选狗枣猕猴桃AkHSP20基因cDNA序列信息，利用在线分析方法对其进行理化性质及结构功能预测。结果显示：AkHSP20基因共编码194个氨基酸，cDNA上第151～732个碱基区域为编码区(CDS)，蛋白中含量富含谷氨酸，属于亲水非稳定的蛋白，不存在信号肽及跨膜结构，保守结构为HSP20(ID 10157978)家族的一员，主要构件为无规卷曲及螺旋，蛋白质修饰位点较多。从植物亲缘关系进化树上分析，AkHSP20与中华猕猴桃原变种亲缘相近，而与其他植物亲缘关系较远。该研究为进一步挖掘AkHSP20基因的功能奠定了基础。