香蓼精油成分及其生理活性分析

伍 燕， 田程飘， 向 霞， 申利群，3*

(1.兴义民族师范学院， 贵州 兴义 562400； 2.广西民族大学 化学化工学院, 广西 南宁 550006； 3.广西林产化学与工程重点实验室, 广西 南宁 550006)

香蓼(Polygonumviscosum)为蓼科蓼属植物，又名辣柳、辣辣草，为一年生草本植物[1]，其叶片和茎散发出一种特殊香味。西南地区的少数民族非常喜爱其香味，如云南的彝族将香蓼叶切碎与捣碎的蜂蛹拌食，贵州布依族在食用牛羊狗肉时将香蓼添加在蘸水中，苗族在酸汤鱼的烹饪中用香蓼叶佐食，土家族利用香蓼叶散发的挥发性物质来熟化柿子。香蓼全草可药用，具有发汗、除湿和消食的功效，其独特的辛辣味和微涩味不仅能掩盖肉类的腥味，还能刺激味蕾、激发食欲。

香蓼全草主要含黄酮类、挥发油类、鞣制类[2]，目前研究集中在对香蓼总黄酮的提取工艺及成分分析上，对香蓼精油活性研究较少[3]。兴义地处温润多雨的亚热带，大陆性季风气候明显，周边水库及低洼湿地多，野生香蓼丰富，且香味浓烈，但当地野生香蓼资源的开发利用目前还是一片空白。为此，笔者等以贵州兴义的野生香蓼为试验材料，采用水蒸气蒸馏法提取香蓼精油，采用GC-MS对精油挥发性成分进行定量和定性分析，检测香蓼精油对多种自由基的清除作用及其对几种常见细菌和真菌的抑菌作用，探索香蓼精油对农作物害虫玉米粘虫的趋避活性，并作出评价，旨在为兴义香蓼精油的开发利用和推广提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

样品：兴义野生香蓼，采集于贵州兴义万峰湖低洼处。

试验菌株：金黄色葡萄球菌(CMCC-26069)，枯草芽孢杆菌(ATCC-6633)、大肠杆菌(ATCC-8739)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC-4532)、热带假丝酵母菌(ATCC-13803)、白色念珠菌(ATCC-10231)，分别从CMCC和ATCC购入。

玉米粘虫：购于河南省济源白云实业有限公司。

仪器与试剂：气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010 Plus，日本岛津公司；水蒸气蒸馏装置，北京欣维尔玻璃仪器有限公司；Thermo Scientific Multi-skan FC酶标仪，美国赛默飞公司；HVS-1000超净工作台，江苏苏净安泰；YXQ-75SII高压蒸汽灭菌锅，上海博讯。2,2′- 联氨 -双( 3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸)二胺盐(ABTs)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，麦克林试剂公司；水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、无水乙醇和二甲基亚砜、丙酮酸，国药集团。

1.2方法

1.2.1样品制备称取新鲜香蓼500 g于2 L圆底烧瓶中，加入1.5 L纯净水，蒸馏时间4 h，经水蒸气蒸馏收集得到香蓼精油[4]。

1.2.2GC-MS分析条件

1) 色谱条件。HP-5弹性石英毛细管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，载气为高纯氦气，流速为1.45 mL/min，分流比50∶1，进样量为1 μL，进样口温度280℃，程序升温为柱温80℃，以3℃/min的速率升至240℃。

2) 质谱条件。电子轰击(EI)能量70 eV，离子源温度220℃，接口温度250℃，溶剂延迟2 min，全扫描，质量扫描范围为50～400 m/z[5]。质谱检索标准库为NIST MS。

1.2.3抑菌试验参照文献[6]并略作修改，采用0.5麦氏标准比浊法，细菌用牛肉膏蛋白胨培养基(LB)，真菌用马铃薯葡萄糖培养基(PDB)，用对应培养基调整各菌液浓度到1×105cfu /mL待用。准确称取250 mg香蓼精油，用二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为0.25 g/mL的母液，用LB或PDB稀释100倍浓度为2 500 μg/mL的工作液。采用对倍稀释法，取无菌96孔板，第一孔和第二孔各加浓度为2 500 μg/mL母液100 μL，第一孔不变，第二孔加100 μL的LB培养基对倍稀释，混匀后吸取100 μL到第三孔，依次重复到第十一孔，使香蓼精油浓度依次为2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL、312.5 μg/mL、156.25 μg/mL、78.12 μg/mL、39.06 μg/mL、19.53μg/mL、9.76 μg/mL、4.88 μg/mL和2.44 μg/mL，再往每孔中加入100 μL浓度为1×105cfu /mL菌液，以LB(真菌用PDB)培养基为空白对照。细菌置于30℃、真菌置于28℃中培养20 h，培养结束后比较试验组与对照组浑浊度差异，肉眼观察到的未浑浊的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)，不同处理3次重复。

1.2.4抗氧化活性试验

1) 香蓼精油工作液配制。参照文献[7]进行，准确称取20 mg香蓼精油，用无水乙醇定容至1 mL，无水乙醇依次稀释成10 mg/mL、8 mg/mL、6 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL和1 mg/mL，待用。

2) ABTs自由基清除试验。取96孔板，依次加入不同浓度香蓼精油50 μL，加入150 μL的ABTs工作液，混匀、避光静置6 min后，在734 nm波长处测定吸光度值，记作Ai(样品吸光度值)；取精油不同浓度样液50 μL，以ddH2O代替ABTs溶液，同法测定吸光度值，记作Aj(样品本底吸光度值)；取50 μL的ddH2O加入150 μL的ABTs溶液，同法测定吸光度值，记作A0(阴性对照)，每个浓度3次重复。ABTs自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

3) DPPH·自由基清除试验。取96孔板，依次加入不同浓度香蓼精油100 μL，加入0.1 mmol/L DPPH工作液100 μL，混匀、避光静置30 min，在517 nm波长处用酶标仪测定吸光度，记作Ai(样品吸光度值)；另取不同浓度样液100 μL加入无水乙醇100 μL，同法测定吸光度，记为Aj(样品本底吸光度值)；另取无水乙醇 100 μL加入DPPH工作液100 μL，测定吸光度记为A0(阴性对照)；以Vc为阳性对照。3次重复。DPPH清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

4)·OH自由基清除试验。取不同浓度样液100 μL，依次加入9.0 mmol/L水杨酸乙醇溶液100 μL、9.0 mmol/L FeSO4溶液100 μL、8.8 mmol/L H2O2溶液100 μL启动反应，混匀后37℃水浴30 min，取200 μL各样液在510 nm波长处测定吸光度，记为Ai(样品吸光度值)；另以ddH2O代替样液，同法测定，记为A0(阴性对照)；以Vc为阳性对照。3次重复。·OH清除率=[ A0-Ai]/A0×100%。

1.2.5香蓼精油对玉米粘虫幼虫拒食活性的测定采用小叶蝶添加法[8]。挑选建康成长的2～3龄玉米粘虫，保持饥饿状态6～8 h后，置于洁净的培养皿中，用丙酮稀释香蓼精油成5个浓度。不同浓度精油分别为0.2 mL/mL、0.1 mL/mL、0.05 mL/mL、0.025 mL/mL 和0.012 5 mL/mL；将新鲜玉米叶剪成边长为3 cm的正方形，将其浸泡于不同浓度香蓼精油中2～3 s后取出，待溶剂挥发干后，置于放有试虫的培养皿内，对照组用丙酮代替精油。分别在6 h、12 h、24 h和48 h后，用坐标方格纸测量拒食面积并计算拒食率，3次重复，求其平均值。拒食率=[(对照组取食面积-处理组取食面积)/对照组取食面积]×100%。

2结果与分析

2.1香蓼精油成分

对图1进行分析可知，香蓼精油共鉴定出32种挥发性化学成分，占总质量的96.01%，其中含量为1%以上成分的有10种，分别为十二烷醛(24.57%)、葵醇(12.08%)、异长叶烯(9.39%)、葵烷(8.14%)、蛇麻烯(5.87%)、石竹烯氧化物(3.05%)、石竹烯(2.36%)、补身醇(2.17%)、倍半香桧烯(1.44%)和α-橄榄烯(1.3%)，这10个成分占精油色谱出峰面积的70.37%(表1)。

图1香蓼精油GC-MS 总离子流图

Fig.1 TIC chromatogram of GC-MS of essential oil fromP.viscosum

表1香蓼精油成分及含量

2.2香蓼精油的抑菌作用

从表2可知，香蓼精油对几种常见细菌及真菌具有一定的抑制作用。香蓼精油对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较好，其MIC值分别为4.88 μg/mL和39.06 μg/mL；对金黄色葡萄球菌的MIC值达78.12 μg/mL。可见香蓼精油对抑制细菌生长的效果较好，对真菌也有一定抑制活性，但MIC值都较细菌的高，热带假丝酵母、白色念珠菌和肺炎克雷伯氏菌的MIC值均在1 250 μg/mL以上。

表2不同浓度香蓼精油对细菌及真菌的抑菌表现

注：“-”表示澄清；“+”表示略浑浊；“++”表示十分浑浊。

Note: "-" means clarification; "+" means slightly turbid; "++" means very turbid.

2.3香蓼精油的抗氧化活性

由图2可知，香蓼精油对ABTs、DPPH和·OH自由基的清除率随香蓼精油浓度的升高呈量效关系。对ABTs的清除率表现较好，在香蓼精油浓度为1 ～ 4 mg/mL时，对ABTs自由基的清除作用上升较快，在4～ 10 mg/mL上升趋势变缓，在10 mg/mL时清除率可达到88%左右，随着浓度的增加对ABTs自由基的清除能力逐渐趋同于Vc，EC50(半数效应浓度)为3.20 mg/mL。香蓼精油对DPPH自由基的清除率随精油浓度的增加上升比较平缓，其EC50为10.87 mg/mL。香蓼精油对·OH自由基的清除率随精油浓度的增加逐渐上升，其EC50为10.24 mg/mL。

图2香蓼精油和Vc 对 ABTs、DPPH及 OH自由基的清除率

Fig.2 Scavenging rates of essential oil fromP.viscosumand Vc on ABTs, DPPH, and OH free radicals

2.4香蓼精油对玉米粘虫的拒食活性

从表3可知，不同浓度的精油对玉米粘虫均具有拒食作用，尤其在6 h拒食活性均达到80%以上，说明玉米粘虫对挥发油中的成分较敏感。当香蓼精油的浓度为0.1 mL/mL，48 h后拒食率仍然达到90%以上，可见高浓度香蓼精油表现出较强的驱虫活性。

表3不同浓度香蓼精油对玉米粘虫的拒食率

3结论与讨论

香蓼精油挥发性成分经GC-MS分析可知，其主要成分有十二烷醛(24.57%)、葵醇(12.08%)、异长叶烯(9.39%)、葵烷(8.14%)、蛇麻烯(5.72%)、石竹烯氧化物(3.05%)、石竹烯(2.36%)、补身醇(2.17%)、倍半香桧烯(1.44%)、α-橄榄烯(1.3%)、香树烯(0.86%)、姜黄烯(0.29%)和月桂烯(0.04%)等具有香味和辛辣刺激性的化合物。香蓼精油具有良好的抗氧化活性，其对ABTs自由基的清除效果显著，EC50为3.20 mg/mL，对DPPH自由基和·OH自由基也有较好的清除效果，其EC50分别为10.87 mg/mL和10.24 mg/mL。

抑菌和拒食活性试验表明，香蓼精油对常见细菌和真菌均具有一定程度的抑制生长作用，对细菌类的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌作用明显，其MIC值分别为4.88 μg/mL和39.06 μg/mL，对真菌类微生物有一定抑制作用，但所需精油浓度较高，均在1 250 μg/mL以上。香蓼精油对玉米粘虫表现出较好的拒食活性，在0.012 5～0.2 mL/mL，前6 h均表现出对玉米粘虫80%以上拒食活性。

香蓼特殊的香辛味来自于其挥发性成分，相关研究表明[9-11]，十二烷醛具有强烈的脂肪香气；葵醇具有蜡香、花香味；异长叶烯是一种倍半萜烯，具有木香香气；葵烷具有刺激作用；蛇麻烯又称α-石竹烯或葎草烯，是一种天然的单环萜烯，其水解产物是产生啤酒特殊香气的关键物质；石竹烯又称β-石竹烯，是一类双环倍半萜类化合物，有辛香、木香、柑橘香、樟脑香及丁香香气；倍半香桧烯在胡椒香气挥发物中存在，具有辛香味。这些气味的综合形成了香蓼独特的香味，在贵州民间饮食调味上占据了一席之地，不仅老百姓爱食用，在贵州遵义国酒董酒的酒曲制作过程中香蓼也是必不可少的重要原料，适当添加香蓼对酵母质量具有良好的促进作用[12-13]，其中脂肪酸类可以促进酿酒酵母的增殖活性[14]，目前香蓼在遵义市已有大面积种植以满足生产需要。

从GC-MS成分分析可知，倍半萜类化合物是香蓼重要的次生代谢产物，由石竹烯、倍半香桧烯、蛇麻烯、石竹烯氧化物、姜黄烯、补身醇、臭根醇和蛔蒿素等构成，相关研究表明[15]，具有倍半萜成分的沃伯格醛(warburganal)具有明显的杀菌活性，倍半萜类成分的8,9-二醛基和7,8位不饱和的Drimane骨架化合物，对昆虫具有很强的拒食活性和趋避活性[16]，研究表明香蓼精油具有丰富的倍半萜类化合物成分[17]，在植物病原菌及病害防治上具有一定的应用前景，香蓼精油对不同自由基有良好的清除作用，可作为天然抗氧化试剂进行开发与利用。