基于ISSR标记的西南地区石斛资源亲缘关系分析

贾 元， 胡利娟， 冯 群， 田忠静， 余 雨， 翁庆北， 朱 斌

(贵州师范大学 生命科学学院， 贵州 贵阳 550025)

石斛是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物的统称，其兼具药用与观赏价值。我国石斛有74种和2个变种，分布于秦岭以南各省区，尤以云南为多[1]，绝大多数为野生状态。石斛的药用价值早在《神农本草经》中就有记载，其具有养阴生津、润肺明目及滋阴清热等功效[2]。石斛在自然条件下种子发芽率低，加上长期采挖和生态破坏，其野生资源环境受严重破坏而成为濒危植物，导致市场上石斛类药材植物紧缺。因此，金石斛属(Flickingeriaalbopurpurea)等近缘属植物常混作石斛类药材使用[3]。

目前，鉴定物种亲缘关系的方法有RAPD[4-5]、AFLP[6-7]、RFLP[8-9]、ISSR[10-11]及DNA条形码[12-13]等，其中ISSR分子标记技术结合了RAPD和SSR分子标记的优点，具有成本低、多态性高及快速准确等特点，已用于不同石斛的群居遗传多样性研究[14]，并取得良好效果。近年来，为保护石斛的野生资源及保障市场需求，对石斛进行相应的引种栽培及杂交选育使石斛属植物种质资源越来越复杂，对石斛资源亲缘关系进行分析，将为石斛的起源、进化研究提供理论依据，也将为野生石斛资源的有效利用及保护提供理论支撑。鉴于此，结合前人的研究，采用ISSR标记技术(简单重复序列间扩增)运用11条引物对采自西南地区的24份石斛植物材料进行遗传多样性及亲缘关系分析，以期为更好地保护、开发和选育优良石斛品种提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

石斛：24份石斛分别采自云南、贵州等地，依据《中国植物志》完成鉴定，所取材料栽培于贵州师范大学温光培养室。试验材料名称及采集地点详见表1。

仪器与试剂：ETC811 PCR仪，东胜创新生物科技有限公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；DYCP-31E型电泳槽，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统K8360，北京科创锐新生物科技有限公司；CTAB、Tris-base、EDTA、苯酚、氯仿、异戊醇、盐酸、无水乙醇、无菌去离子水等，贵州凯信生物科技有限公司；2 × Taq MasterMix (Dye)，北京康为世纪生物科技有限公司；ISSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1石斛材料名称及采集地点

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取从实验室栽培的石斛植株上摘取幼嫩叶片，参考CTAB法[15]加以改进提取植物基因组DNA。具体方法：剪取石斛幼嫩叶片0.1 g放在研钵中，加入750 μL 2% CTAB充分研磨，转入1.5 mL离心管中，65℃水浴1 h(每隔20 min摇匀1次)；取出离心管冷却到室温在通风橱里通风状态下加入750 μL的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒混匀；12 000 r/min离心15 min，取上清液500 μL于新的离心管中，然后向上清中加入-20℃的无水乙醇1 mL沉淀DNA，-20℃存放20 min；8 000 r/min离心5 min去除上清液，沉淀用75%的乙醇清洗3次，第3次清洗时不必倒出，放置过夜，第2天离心倒掉上清液；室温下晾干或通风橱干燥后加入 200 μL无菌去离子水溶解后置-20℃保存；取2 μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.2.2引物筛选ISSR引物的合成根据杨立昌等[15-17]公布的引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，通过用合成的20条引物对8份石斛植物材料基因组DNA进行预试验扩增，从中筛选出扩增产物条带清晰、多态性较好的引物用于24份石斛种质资源遗传多样性分析。

1.2.3ISSR-PCR扩增参考ISSR反应体系[17-18]稍加改进：PCR反应体积20 μL，包含稀释过的DNA模板2.0 μL，MIX 8.0 μL引物(10 μmol/L)1.0 μL，无菌去离子水9 μL。PCR扩增程序参考孔琼等[17-18]并加以改进，具体：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，退火45 s(退火温度由引物而定，具体见表2)72℃延伸2 min，共45个循环，72℃复性7 min，4℃保存PCR产物。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳检测。使用Super DNA marker 标定扩增片段长度，在90 V电压下，电泳1.5 h后置于凝胶成像系统上观察、照相，检测ISSR-PCR谱带。考虑条带清晰度，因而采用17孔电泳槽梳子加大扩增产物剂量，因此下面扩增电泳图谱仅部分呈现。

表2 不同ISSR引物序列及ISSR扩增情况

1.3数据处理与分析

根据凝胶成像系统拍摄的照片，统计清晰、稳定、可分辨的扩增条带，有带的记为“1”，无带的记为“0”，构成0/1矩形图，利用NTSYS 2.10 SHAN程序中的UPGMA(非加权平均距离法)对样品进行聚类分析，构建24份石斛植物的亲缘关系树状图。

2结果与分析

2.1供试石斛的扩增情况

从石斛的扩增电泳图谱(图1)看出，11条引物对24份石斛材料的扩增长度在250～2 000 bp。从表2看出，共检测出151个扩增位点，平均每条引物扩增位点为13.7个；其中多态性位点148个，多态性位点率为98.01%。24份石斛总扩增条带1 084条，各石斛扩增条带在36～53条，平均45.17条；其中多态性条带有1 012条，占比为93.4%。说明，供试样品具有较高的多态性。

2.2供试石斛的遗传相似性及亲缘关系

UPGMA法构建供试材料的聚类结果(图2)显示，11条引物能将24份石斛分开，遗传相似系数在0.63～0.78，表明供试样品具有较近的亲缘关系。在相似系数0.68处，可将24份石斛材料分为7个类群。

注：M为marker，1～15分别对应表1中编号为1～15的石斛材料。

Note: M is a marker, and 1-15 correspond toDendrobiummaterials numbered 1-15 in Table 1, respectively.

图1引物UBC900和 CTC4Rcb对石斛的ISSR扩增图谱

Fig.1 ISSR amplification of primers UBC900 and CTC4Rcb onDendrobium

图224份石斛植物样品的聚类分析

Ⅰ类包括铁皮石斛、长苏石斛和报春石斛。Ⅱ类分为A组和B组，A组包括小龟背石斛、澳洲石斛、血喉石斛、樱石斛、黄喉石斛、具槽石斛、春石斛和独角石斛，B组包括重唇石斛、鼓槌石斛、霍山石斛、天宫石斛、尖刀唇石斛和黑毛石斛，其中重唇石斛和鼓槌石斛是24份石斛材料中亲缘关系最近的，遗传系数超过了0.77。Ⅲ类由金石斛属的金果石斛构成，说明，金石斛属与石斛属存在一定差异。Ⅳ类包括美花石斛和短棒石斛。Ⅴ类包括叠鞘石斛和大苞鞘石斛。Ⅵ类仅有竹叶石斛，Ⅶ类仅有秋石斛，秋石斛与其他23份石斛材料的距离最远，遗传相似系数仅为0.63。

3结论与讨论

在传统分类中，吉占和[19]把我国石斛属的74个种划分为12个组，分别是禾叶组、顶叶组、石斛组、心叶组、瘦轴组、叉唇组、距囊组、黑毛组、草叶组、基肿组、剑叶组和圆柱叶组。研究结果显示，Ⅰ类的铁皮石斛、长苏石斛和报春石斛，Ⅳ类的美花石斛和短棒石斛，Ⅴ类的叠鞘石斛和大苞鞘石斛均归属石斛组，其各自组为一类群，与传统的分类一致；但Ⅱ类由2个组混合在一起聚为同一类，与传统分类不一致。将Ⅳ类的美花石斛和短棒石斛与卢家仕等[16]对不同产地石斛属种质资源的ISSR遗传多样性分析聚为一类的研究结果一致，与武荣花[20]的把Ⅰ类的铁皮石斛、长苏石斛和报春石斛聚为同一类的研究结果一致，但与朱胜男等[21]的研究有部分不一致。

聚类分析结果与传统的分类方法和前人对部分石斛聚类分析基本一致，但有少数存在一定的差异，可能与石斛长期人为或者自然的异花授粉和自然选择及遗传背景有关。某些种之间的形态特征相差甚远，有些石斛种后代有可能形成多种的基因型，根据形态学和地理分布进行分类具有一定的局限性，外部的形态特征受隐性基因、环境各方面条件的影响，仅从形态学和地理分布不能科学判断其亲缘关系的远近。石斛的亲缘关系需要从形态学与分子相结合来研究，才能得出较为准确的结论。DNA分子标记不受环境影响，能直接反应基因组DNA间的差异性，能够在分子水平上对植物进行准确分类和鉴别。但是石斛的遗传背景较为复杂，单一的分子标记分析其遗传多样性不够客观，今后应结合多种标记技术和传统形态学方法对石斛属植物进行深入研究，对来自不同地方的品种及同名异种、同种异名的品种资源进行分析，对石斛进行准确分类和鉴别，进而为药用及观赏等石斛种质资源的合理开发和利用提供更好的借鉴。