酶解法制备榛子粕ACE抑制肽工艺研究

殷金莲， 靳 毓

(1.朔州职业技术学院 生物工程系，山西 朔州 036002； 2.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

榛子别名山板栗，棰子。榛子果仁营养丰富，主要含脂肪50%～60%、蛋白质12%～25%、糖类9%～12%。另外，榛子果仁中胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、维生素E和钙、磷、铁等微量元素含量也很丰富[1]，包含人体所需的8种必需氨基酸，有“坚果之王”的称号。

血管紧张素转化酶(ACE)能催化无活性的血管紧张素I转化为具有血管收缩活性的血管紧张素II[2-3]，ACE抑制剂通过抑制此反应的进行起到降低血压的作用。具有ACE抑制作用的降压药物卡托普利、依那普利、贝那普利等对身体有一定副作用和限制使用范围，因而近些年来寻求安全、无副作用的食源性ACE抑制肽引起了国内外学者的广泛关注。经试验证实，水稻、大豆、豌豆、小麦、松仁等植物蛋白[4-5]和一些海洋生物蛋白[6-7]的酶解产物均对ACE有一定的抑制作用。

目前,国内对榛子的研究多是榛子油提取[8]、蛋白[9]提取、榛子酶解抗氧化肽制备与分离[10-11]等，而对榛子肽降血压作用的研究很少。Eroglu等[12]初次证实了胃蛋白酶水解榛子蛋白的水解产物有一定的抗高血压活性。Gülseren[13]研究比较了3种胃肠道蛋白酶和3种非胃肠道蛋白酶水解榛子蛋白所得产物的抗高血压效果，结果显示非胃肠道蛋白酶酶解产物的ACE抑制效果较好。Liu等[14]研究了榛子ACE抑制肽的构效关系，证实ACE抑制肽是通过非竞争模式抑制ACE活性的。这些研究为榛子蛋白和多肽具有降血压的生物活性提供了依据。

榛子粕作为榛子提油后的副产品，富含蛋白质和各种营养素，由于榛子粕的适口性差，多被用作动物饲料或作为废弃物丢掉。本试验以榛子为原料，利用超声波提取榛子油后得到副产品榛子粕，用中性蛋白酶酶解，研究其酶解产物的ACE抑制活性并对酶解条件进行优化，以期为榛子的生物功效、综合利用和深加工提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

榛子，市场采购；中性蛋白酶(酶活150 U/mg)，东恒华道生物科技有限责任公司；酪蛋白磷酸肽，上海超研生物科技有限公司；马尿酰-组胺酰-亮氨酸(HHL)，上海酶联生物研究所；ACE(酶活2 U/mg)，上海倍卓生物科技有限公司；石油醚、硼酸钠、氯化钠，均为分析纯。

AF-I型电子恒温水浴箱；分析天平；PM180R高速冷冻离心机(Alc International Srl)；PHS-3C精密pH计；UV-1700紫外可见分光光度计，日本岛津；KH2200DB台式数控超声仪。

1.2 试验方法

1.2.1 榛子脱脂

先将榛子去壳、干燥、粉碎处理。称取榛子粉10 g，按料液比1∶8加入石油醚， 在超声波功率500 W、60℃条件下提取60 min，抽滤去除有机溶剂，用少量的石油醚洗涤滤渣2～3次，滤渣冷冻干燥即为榛子粕，-18℃冰箱冷冻保存待用。

1.2.2 榛子粕ACE抑制肽的制备

取榛子粕加入蒸馏水搅拌溶解，100℃水浴预处理30 min，冷却，调节pH，加入中性蛋白酶酶解一定时间后，水解液100℃灭酶15 s，5 000 r/min离心15 min，上清液即为含ACE抑制肽的酶解液。

1.2.3 ACE抑制率的测定

采用Cushman等[15]的方法并加以改进。分别取75 μL 5 mmol/L HHL溶液、25 μL去离子水、25 μL酶解液，混合均匀后置于37℃恒温水浴中预热5 min，加入25 μL 0.1 U/mL ACE酶液，37℃恒温保持30 min，反应结束后加入0.25 mL 1 mol/L的HCl终止反应，再加入1.5 mL乙酸乙酯混合15 s，将混合液4 000 r/min离心10 min后，吸取1 mL乙酸乙酯层溶液，120℃烘干30 min，冷却后再溶于3 mL去离子水中，混合均匀在228 nm处测定吸光度。按下式计算ACE抑制率。

ACE抑制率=(A1-A2)/(A1-A3)×100%

式中：A1为不加酶解液的溶液吸光度；A2为加入ACE和酶解液的溶液吸光度；A3为不加ACE的溶液吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 底物质量分数的影响

在酶用量0.3%、酶解温度45℃、pH 7.5、酶解时间1.5 h条件下，考察底物质量分数对酶解产物ACE抑制率的影响，结果如图1所示。

图1 底物质量分数对ACE抑制率的影响

由图1可知，随着底物质量分数的增大，酶解产物的ACE抑制率呈增大趋势，当底物质量分数达到5%后ACE抑制率增幅平缓。这是因为在一定范围内，随着底物质量分数的增大，酶解释放大量的活性肽分子，当底物质量分数过大时，一方面没有足够的酶催化底物反应，另一方面酶解液过于黏稠，整体浓度增大，影响酶解效率[16]。

2.1.2 酶用量的影响

在底物质量分数5%、酶解温度45℃、pH 7.5、酶解时间1.5 h条件下，考察酶用量对酶解产物ACE抑制率的影响，结果如图2所示。

图2 酶用量对ACE抑制率的影响

由图2可知，随着酶用量的增大，酶解产物的ACE抑制率先增大后降低，当酶用量达到0.3%时，ACE抑制率达到最大。原因可能是酶用量过大，酶解产物被进一步分解成更小的肽分子或者游离氨基酸，使得ACE抑制率降低。

2.1.3 酶解温度的影响

在底物质量分数5%、酶用量0.3%、pH 7.5、酶解时间1.5 h条件下，考察酶解温度对酶解产物ACE抑制率的影响，结果如图3所示。

图3 酶解温度对ACE抑制率的影响

由图3可知，随着酶解温度的升高，酶解产物的ACE抑制率先升高后降低，40℃时ACE抑制率达到最大。可能是由于此时酶活性较高，能水解蛋白质释放出较多的具有抑制ACE活性的肽分子，当酶解温度过高时，蛋白质变性，酶构象发生变化，导致酶解效率降低[17]。

2.1.4 pH的影响

在底物质量分数5%、酶用量0.3%、酶解温度45℃、酶解时间1.5 h条件下，考察pH对酶解产物ACE抑制率的影响，结果如图4所示。

图4 pH对ACE抑制率的影响

由图4可知，当pH 为7.5时，酶解产物的ACE抑制率最高。在不同pH条件下，酶活性不同，酶与蛋白质底物的接触位点也不同，对蛋白质的酶解效果不同，因而导致酶解产物及其生物活性不同[7]。

2.1.5 酶解时间的影响

在底物质量分数5%、酶用量0.3%、酶解温度45℃、pH 7.5条件下，考察酶解时间对酶解产物ACE抑制率的影响，结果如图5所示。

由图5可知，随着酶解时间的延长，酶解产物的ACE抑制率先增大，酶解1.5 h后略有下降趋势。这可能是因为随着酶解时间的延长，蛋白质水解度也增大，释放出大量的 ACE 抑制肽，但酶解时间过长，一些ACE 抑制肽会被蛋白酶进一步水解为无活性的小分子肽[18-19]或游离氨基酸，使得 ACE 抑制率下降。

图5 酶解时间对ACE抑制率的影响

2.2 响应面优化试验

根据单因素试验结果，固定酶解时间1.5 h，选择底物质量分数(A)、酶用量(B)、酶解温度(C)和pH(D)为自变量，ACE抑制率(Y)为响应值，利用Design-Expert8.0.6软件进行四因素三水平 Box-Behnken 中心组合试验，对酶解条件进行优化。响应面试验因素水平见表1，响应面试验设计方案及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表1 响应面试验因素水平

表2 响应面试验设计方案及结果

续表2

试验号ABCDY/%1810-1079.3519-101084.3120101086.57210-10-179.0222010-182.16230-10187.3324010189.4125000090.2826000091.0627000089.9228000090.3929000091.18

表3 回归模型方差分析

注：*为P<0.05，差异显著；**为P<0.01，差异极显著。

对表2的试验结果进行多元回归分析得到相应的二项式拟合方程:

Y=90.57+0.65A+1.08B+3.04C+3.38D+0.93AB+0.39AC-0.047AD+ 0.16BC-0.27BD+0.50CD-2.31A2-3.05B2-5.48C2-2.49D2

各酶解因素影响酶解产物ACE抑制率的显著程度顺序为D>C>B>A，即pH>酶解温度>酶用量>底物质量分数。其中B、C、D达到极显著水平，A达到显著水平，A2、B2、C2、D2均达到极显著水平，各因素交互作用对ACE抑制率的影响均不显著。

经Design-Expert软件模拟分析，得到酶解榛子粕制备ACE抑制肽的最佳条件为底物质量分数5.2%、酶用量0.32%、酶解温度41.6℃、pH 7.35，ACE抑制率为92.399 4%。在实际操作过程中为了方便与可控，将最佳条件各指标数值修正为底物质量分数5%、酶用量0.3%、酶解温度40℃、pH 7.5，在此条件下重复3次试验，ACE抑制率的平均值为91.76%，相对误差为0.69%(<1%)。说明用响应面模型预测得到的理论值与实际值拟合度高，用此模型对酶解条件进行优化是合理可行的，结果也是可靠的。

3 结 论

榛子脱脂后得到富含蛋白质的榛子粕，经中性蛋白酶酶解后的酶解产物榛子多肽具有ACE抑制活性。以ACE抑制率为指标，利用单因素试验和响应面法分析得到的最佳酶解条件为：底物质量分数5%，酶用量0.3%，酶解温度40℃，pH 7.5，酶解时间1.5 h。在最佳条件下，ACE抑制率为91.76%。