蚕蛹油和蚕蛹蛋白组成及潜在过敏原分布研究

谢盛莉，张宇昊,，马 良,，侯 勇，戴宏杰，周鸿媛，郭 婷，余 永

(1.西南大学 食品科学学院，重庆 400715； 2.西南大学 前沿交叉学科研究院，生物学研究中心, 重庆 400715)

蚕蛹是蚕蛾科家蚕蛾的蛹，属于蚕茧抽丝后的副产物。我国的蚕蛹年产量超过30 万t，约占世界总产量的80%[1]。作为一种富含营养物质的食源性昆虫，蚕蛹于1998年被卫生部批准为“可作为普通食品管理的新资源食品”，是第一个被认定的昆虫类食品。但长期以来蚕蛹利用率较低，资源浪费较多。

在新型蚕蛹食品开发方面，重点是脂肪和蛋白的利用。蚕蛹油中含有多种对人体有益的不饱和脂肪酸。蔡沙等[2]采用气相色谱法测定了精炼蚕蛹油的脂肪酸组成，不饱和脂肪酸含量占 75.40%；张研宇等[3]利用气相色谱对正己烷提取的蚕蛹油中不饱和脂肪酸含量进行了测定，其含量占72.8%。

蚕蛹中蛋白质含量十分丰富，其研究主要集中在基于一级结构的营养性评价及活性多肽制备等方面。吕汶骏等[4]研究表明蚕蛹蛋白中8 种必需氨基酸占比达到 49.09%，高于 FAO/WHO 建议必需氨基酸占比40%。活性肽的制备及其构效研究是目前蚕蛹蛋白研究的热点。Jia等[5]成功纯化出一种新的三肽Lys-His-Val，其ACE抑制活性较强，IC50值为12.82 μmol/L，并且对胃肠道蛋白酶稳定。蚕蛹蛋白同样具备良好的功能特性。练钊等[6]采用Osborn法提取缫丝后蚕蛹中的水溶性、盐溶性、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白，并对这4种蛋白的含量及相关功能进行了研究。结果表明：蚕蛹中水溶性蛋白的氮溶解指数为97.19%，具有良好的溶解性；醇溶性蛋白具有很好的乳化性，乳化活性达到46.38 m2/g；盐溶性蛋白具有良好的保油性。由此可见，蚕蛹蛋白按照溶解性分级后，可依据其功能特性被广泛应用于不同食品加工领域。

目前食品领域内未见到成熟且商业化的蚕蛹相关产品，主要瓶颈在于蚕蛹具有致敏性，部分人食用蚕蛹后会出现头晕、恶心、呕吐等不良反应，甚至会出现直接休克的严重致敏反应。因此，要充分地开发和利用蚕蛹蛋白资源，同时考虑到食品安全性，必须解决蚕蛹致敏问题。研究表明蚕蛹蛋白的过敏原主要包括卵黄原蛋白[7-8]、热休克蛋白[7-9]、胰凝乳蛋白酶抑制剂[7-9]、丙糖磷酸盐异构酶[7-9]、30K家族蛋白[7-11]、硫醇过氧化还原酶[12]、化学感受蛋白[12]、几丁质酶[13-14]、表皮蛋白[15-16]、LOC蛋白[17]、副肌球蛋白[14]和27 kDa血淋巴糖蛋白[18]等。但对于过敏原在蚕蛹蛋白中的分布规律未见报道，严重限制了蚕蛹蛋白在食品工业中的广泛应用。

本研究在蚕蛹基本成分分析的基础上，采用气相色谱-质谱法测定了蚕蛹油的脂肪酸组成，重点分析了蚕蛹蛋白的成分，并系统研究了蚕蛹蛋白中潜在过敏原分布，以期为蚕蛹在食品工业中的开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

鲜蚕蛹：家蚕实验品种“夏芳”(家蚕基因组生物学国家重点实验室提供)，25℃、桑叶饲养,化蛹后第3天放置于-20℃冻存备用。

石油醚、硫酸、盐酸、硼酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、甲基红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、乙酸镁、酒石酸钠钾、亚铁氰化钾、乙酸锌、葡萄糖、无水乙醇(99.9%)、氯化钠、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、甲醇、冰乙酸、三羟甲基氨基甲烷、无水硫酸钠、尿素、碘乙酰胺、三氟乙酸、四甲基乙二胺、30%丙烯酰胺、1.5 mol/L Tris-HCl、1.0 mol/L Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、4×loading buffer(非还原)、2×loading buffer(非还原)、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、蛋白质Marker(10～200 kDa)等均为市售分析纯，正己烷、甲酸为色谱纯，胰蛋白酶(酶活性≥4 500 U/mg，测序级，重庆鼎国生物技术有限责任公司)，实验用水均为二次蒸馏水。

1.1.2 仪器与设备

DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，JA3003B电子天平，九阳料理机，JHH-6数显恒温水浴锅，DW-3数显电动搅拌器，KQ3200DV数控超声波清洗器，Heraeus Multifuge X3R高速冷冻离心机，PHS-25数显酸度计 ，Power PacTM基础电泳仪，K5800C超微量紫外分光光度计，RE52CS-1旋转蒸发仪，FD-1A-50冷冻干燥机，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，GC-2010气相色谱质谱联用仪，Q-Exactive 液相色谱质谱联用仪。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜蚕蛹主要成分测定

参照GB 5009.3—2016中第一法，直接干燥法测定水分含量；参照GB 5009.6—2016中第一法，索氏抽提法测定脂肪含量；参照GB 5009.5—2016中第一法，凯氏定氮法测定蛋白质含量；参照GB 5009.4—2016第一法，测定灰分含量；参照GB/T 9695.31—2008中第二法，测定总糖含量。

1.2.2 蚕蛹预处理

将解冻的鲜蚕蛹用水清洗并除去杂质，然后在60℃恒温鼓风干燥箱中干燥24 h，干蚕蛹用九阳料理机粉碎后备用。

1.2.3 蚕蛹油提取

将粉碎的蚕蛹经石油醚索氏提取蚕蛹油。提取条件为料液比1∶20、提取温度50℃、提取时间8 h，采用旋蒸除去石油醚，得到蚕蛹油。

1.2.4 蚕蛹蛋白提取

参照Osborn方法[19]将脱脂蚕蛹粉按其溶解性的不同进行连续累进提取。

按照水、70%乙醇、3%NaCl、0.1%NaOH的溶剂顺序进行连续提取，料液比1∶10，电磁力搅拌 3 h，30℃、100 W超声30 min, 5 000 r/min离心10 min, 提取液调节pH至等电点，沉淀透析48 h后冷冻干燥，即得各类可溶性蚕蛹蛋白。洗涤离心沉淀物至中性，通过200目滤布过滤除去蛹壳，冷冻干燥得不溶性蚕蛹蛋白。按下式计算各类蛋白相对含量。

式中：m为各类蛋白质量；m0为总蛋白质量。

1.2.5 气相色谱-质谱法分析蚕蛹油脂肪酸组成

甲酯化：称取约0.5 g蚕蛹油，加入5 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液，35℃水浴振摇反应1 h，加入0.5 g无水Na2SO4及5 mL正己烷密封，4℃反应24 h后，将上清液用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液，用于气相色谱-质谱分析。

气相色谱条件：DB-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；采用程序升温，初始温度150℃保留5 min，3℃/min 升温至230℃，保留10 min；进样口温度250℃；检测器温度280℃；载气流量20 mL/min;进样量1 μL;分流比20∶1。

质谱条件：离子源温度250℃；接口温度250℃；溶剂延迟时间3 min；检测器电压0.1 kV。

由NIST08标准质谱图数据库鉴定脂肪酸成分，按峰面积归一化法计算脂肪酸相对含量。

1.2.6 可溶性蛋白等电点的测定

参照王青松等[20]方法，略作修改。首先采用超微量紫外分光光度计测定各类可溶性蛋白提取液的蛋白质质量浓度，将pH分别调节至2、3、4、5、6后，5 000 r/min离心10 min，利用超微量紫外分光光度计测定上清液的蛋白质质量浓度。然后在最低质量浓度的pH附近设定一个范围，在此范围内以0.2个pH为梯度单位，调节pH后离心，测定上清液蛋白质质量浓度，确定质量浓度最小的pH为等电点。重复测定3次。

1.2.7 SDS-PAGE测定蚕蛹蛋白相对分子质量

参照杨晖等[21]的方法并略作修改。

(1)样品前处理：将水溶性、醇溶性、盐溶性蛋白配制成5 mg/mL溶液，与4×loading buffer按照1∶4 的比例混合均匀；称取适量的碱溶性、不溶性蛋白，加入等体积的1 mol/L DTT和2×loading buffer，超声溶解30 min，离心取上清液。将各类混合液于沸水中煮沸5 min后立即放入4℃冰箱快速冷却。

(2)制备12%的分离胶，5%的浓缩胶。

(3)上样Marker和样品各10 μL，先以15 mA恒流电泳，待样品跑到分离胶后，将电流增至 25 mA，当溴酚蓝跑到分离胶底部时停止电泳。考马斯亮蓝R-250染色1 h后脱色，每30 min换一次脱色液直至蛋白条带清晰，用凝胶成像系统拍摄电泳图谱分析。

1.2.8 液相色谱-质谱法鉴定蚕蛹蛋白潜在过敏原

样品前处理：将约300 μg蛋白样品加入200 μL 8 mol/L尿素中，混匀，室温离心20 min，重复几次，加入4 μL 1 mol/L DTT、150 μL 8 mol/L 尿素，37℃温育2 h，加入15 μL 1 mol/L 碘乙酰胺，室温下避光1 h，离心20 min。加入200 μL 8 mol/L尿素离心，重复几次，再加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液离心，重复几次，用400 μL 10 μg/mL 胰蛋白酶酶解(37℃，36 h)，离心20 min，加入40 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液，4℃离心，冷冻干燥，得到肽段。以上离心过程均取上清。

肽段脱盐：肽段样品用 200 μL 0.1% 三氟乙酸复溶，利用 Zip Tip C18 微量脱盐柱，使样品中的肽段与脱盐柱结合。将脱盐柱上结合的肽段洗下，4℃离心，冷冻干燥，得到脱盐后的肽段。

上机液制备：将脱盐后的肽段用 0.1%甲酸水溶液进行复溶，振荡30 s，室温离心10 min， 吸上清15 μL于上样瓶中。

液相色谱条件：上样量为 2 μL，吸样流速为8 μL/min，使用3.5 μL/min 的流速将 16 μL A 相溶液(0.1%甲酸水)推入预柱(100 μm×2 cm， C18，5 μm，100 Å，nanoViper，)和分析柱(50 μm×15 cm， C18，2 μm，100 Å，nanoViper)中，肽段分离用梯度B相溶液(0.1% 甲酸-乙腈)进行洗脱，流速为250 nL/min。有效色谱梯度时间为60 min线性梯度。

质谱条件：检测时间0～60 min，喷雾电压2.3 kV，离子传输管温度 275℃； 离子模式为正离子模式，默认电荷为两个，全扫描的分辨率70 000，扫描范围(m/z)300～1 800，二级扫描分辨率17 500，采用 Top 20 进行数据采集，动态排除时间30 s。质谱环境温度 22℃，空气湿度 50%。

质谱数据匹配：原始数据采用 MaxQuant(版本 1.3.0.5)搜库，数据库为 2016 年 7 月从 NCBI和 SilkDB下载，这两个数据库共包含32 835 条家蚕蛋白质序列。搜库参数为可变修饰选择 Oxidation (M)和 Acetyl(Protein N-term)，酶切位点选择 Trypsin/P，最大漏切位点为两个，最大带电荷数为 7，Protein FDR 为 0.01，最小肽段长度为 6。 得到的数据去除污染序列数据和反向序列数据后，即得到原始数据导出到Excel，可用于后续分析。按下式计算过敏原相对含量。

式中：iBAQ为过敏原丰度；iBAQ0为总蛋白丰度。

1.2.9 数据分析

采用软件Origin9.0和Excel 对数据进行统计与分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 鲜蚕蛹主要成分(见表1)

表1 鲜蚕蛹主要成分 %

由表1可知，鲜蚕蛹水分含量为74.63%，蛋白质含量为14.30%，脂肪含量为6.82%，灰分含量为1.44%，总糖含量仅为1.14%。由此可知，蚕蛹干基蛋白质含量达到56.37%，脂肪含量为26.88%，是鲜蚕蛹的主要营养物质，蚕蛹食品的发展应该围绕着蛋白和脂肪进行进一步的研发。

2.2 蚕蛹油主要脂肪酸组成(见表2)

从表2可以看出，蚕蛹油中主要含有11种脂肪酸，以不饱和脂肪酸为主，相对含量为60.83%，饱和脂肪酸占35.64%。蔡沙[2]、张研宇[3]等检测的蚕蛹油中不饱和脂肪酸含量略高于本实验测定结果，可能与采用的检测方法不同及家蚕的品种、饲养条件及地域差异相关。

表2 蚕蛹油主要脂肪酸组成 %

蚕蛹油中的不饱和脂肪酸包括棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸，油酸的相对含量高达35.43%，其次为α-亚麻酸，相对含量为20.17%。棕榈油酸和油酸对降低血压、血脂、血糖有明显的作用，还有保护心脏以及预防心血管疾病的作用[22-23]；亚油酸和α-亚麻酸是必需脂肪酸，可以调节机体的脂类代谢和免疫力，同时还能够预防和治疗心血管疾病，预防癌症、促进机体生长发育以及调控基因的表达等[24]。

2.3 可溶性蚕蛹蛋白等电点(见图1～图4)

图1 水溶性蛋白等电点

图2 醇溶性蛋白等电点

图3 盐溶性蛋白等电点

图4 碱溶性蛋白等电点

由图1～图4可知，水溶性蛋白的等电点是3.8，醇溶性蛋白的等电点是4.2，盐溶性蛋白等电点是2.0，碱溶性蛋白等电点是4.4附近。由此可见，蚕蛹中几种蛋白等电点主要分布在酸性一侧，醇溶性蛋白和碱溶性蛋白的等电点与常用的大豆蛋白的等电点比较接近，但水溶性蛋白和盐溶性蛋白等电点相对较低，表明了这两种蛋白在弱酸性体系下更加稳定，更适合在偏酸性食品加工中添加使用。

2.4 不同种类蚕蛹蛋白相对含量

不同溶解性的蚕蛹蛋白相对含量如表3所示。

表3 各类蛋白相对含量

由表3可知，不溶性蛋白相对含量最高，占53.00%，其次为水溶性蛋白，相对含量为23.63%，碱溶性蛋白相对含量为19.73%，盐溶性蛋白和醇溶性蛋白相对含量较低，分别为2.58%和1.06%。这些蛋白拥有不同的功能特性，如水溶性蛋白溶解性较好，可应用于功能蛋白饮料的开发；盐溶性蛋白持油性较好，可应用于肉制品加工中的保油处理；醇溶性蛋白乳化性较好，更适合应用于食品乳化体系中。由于蚕蛹蛋白存在过敏原，容易引发食品安全事件，因此需对各类蛋白潜在过敏原的分布进行探究与分析，为其安全利用提供理论依据。

2.5 各类蛋白相对分子质量分布(见图5、图6)

由图5可知，盐溶性蛋白亚基主要分布在15～35 kDa之间，其中15 kDa和32 kDa的组分含量较高，35 kDa附近还有一个亚基，含量相对较低。水溶性蛋白亚基主要分布在25～85 kDa范围内，其中含量较高的亚基包括25～32 kDa和75～85 kDa范围内的组分，48 kDa附近还有一个含量较高的亚基，其他组分含量较低。碱溶性蛋白亚基主要分布在13～29 kDa之间，含量较高亚基组分在13、17、29 kDa。碱溶性蛋白的条带背景颜色较深，可能是残留的碱与染色剂之间的反应造成拖尾现象。醇溶性蛋白相对分子质量都在20 kDa以下，亚基主要分布在12 kDa和20 kDa附近，为小分子物质，条带的颜色较浅，可能是由于乙醇的存在，蛋白溶液与缓冲液混合后的样液进样时不能完全地进入电泳孔。由图6可知，不溶性蛋白亚基分布在27～85 kDa之间，其中27～32 kDa和70～85 kDa范围内的组分含量较高，40～50 kDa亚基含量较低，此外在12～17 kDa也有少量的亚基分布。综上分析可知蚕蛹蛋白中小分子蛋白居多。

注：1.Marker； 2.盐溶性蛋白； 3.水溶性蛋白； 4.碱溶性蛋白； 5.醇溶性蛋白。

图5 可溶性蛋白SDS-PAGE图谱

注：1.Marker； 2.不溶性蛋白。

2.6 蚕蛹蛋白潜在过敏原分布(见表4)

由表4可知，水溶性、醇溶性、盐溶性、碱溶性蛋白及不溶性蛋白中致敏蛋白相对含量分别为1.33%、25.64%、1.21%、17.93%和9.86%。蚕蛹蛋白中共匹配出8类已经有免疫反应的潜在过敏原，包括30K家族蛋白、几丁质酶、卵黄原蛋白、热休克蛋白、表皮蛋白、硫醇过氧化还原酶、化学感受蛋白和LOC蛋白，其中30K家族蛋白包括4种，表皮蛋白包括2种。致敏蛋白分布结果显示，各类蛋白均有过敏原存在：醇溶性蛋白中致敏蛋白相对含量最高，达到25.64%，所包括的致敏蛋白种类也较多，有3种30K家族蛋白、2种表皮蛋白、热休克蛋白、化学感受蛋白和LOC蛋白；碱溶性蛋白中所含致敏蛋白种类最多，有4种30K家族蛋白、2种表皮蛋白、几丁质酶、卵黄原蛋白、热休克蛋白、硫醇过氧化还原酶、化学感受蛋白和LOC蛋白，相对含量也达到17.93%；不溶性蛋白中致敏蛋白相对含量为9.86%，种类较少，仅存在2种30K家族蛋白和硫醇过氧化还原酶，且这3种都是在碱溶性蛋白中大量检出的，推测可能是碱溶性蛋白未充分洗涤而造成的残留；水溶性蛋白和盐溶性蛋白中所含有致敏蛋白种类也较多，分别包括3种30K家族蛋白、1种表皮蛋白、几丁质酶、化学感受蛋白和3种30K家族蛋白、2种表皮蛋白、几丁质酶、热休克蛋白、化学感受蛋白，但相对含量较少，分别为1.33%和1.21%。

表4 蚕蛹蛋白潜在过敏原分布

注：BGI序列来自SilkDB数据库；ref序列来自NCBI数据库；“-”表示未发现、未检出。

从过敏原的检出种类来看，30K家族蛋白在5类蛋白中均有分布，表皮蛋白和化学感受蛋白在4类可溶性蛋白中均检出，几丁质酶在水溶性、盐溶性、醇溶性3类蛋白中存在，热休克蛋白在醇溶性、盐溶性、碱溶性3类蛋白中检出，LOC蛋白在醇溶性、碱溶性2类蛋白中检出，在碱溶性蛋白和不溶性蛋白中检出硫醇过氧化还原酶，仅在碱溶性蛋白中检出卵黄原蛋白。由此可见30K家族蛋白是蚕蛹蛋白中主要的潜在过敏原，在5类蛋白中均存在。Zuo等[25]研究表明30K家族蛋白中的Bom m 9是一种与哮喘相关过敏原，参与了哮喘的发病机制，并成功以这种蛋白构建了过敏性哮喘的小鼠模型。

基于以上数据分析，在食品工业的应用中，水溶性蛋白和盐溶性蛋白过敏原含量很低，适合直接开发蛋白产品或者用于食品添加。不溶性蛋白中所含过敏原种类较少，且经过充分碱洗后，可以作为食品加工过程中用于改善产品功能特性的添加物使用，但同时应注明可能存在的过敏原。醇溶性蛋白和碱溶性蛋白中过敏原含量较高，必须经过脱敏处理后才能进行相关的应用，活性肽的开发是较好的应用方向，因为酶解是一种很好的脱敏方法。

3 结 论

(1)蚕蛹油中脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，占60.83%，其中油酸的相对含量最高，达到35.43%。

(2)蚕蛹蛋白中不溶性蛋白相对含量最高，为53.00%，蛋白亚基主要分布在27～32 kDa和70～85 kDa之间；水溶性蛋白占23.63%，等电点为3.8，蛋白亚基主要分布在25～32 kDa和75～85 kDa之间；碱溶性蛋白占19.73%，等电点为4.4，蛋白亚基主要分布在13～29 kDa之间；盐溶性蛋白占2.58%，等电点为2.0，蛋白亚基主要分布在15～35 kDa之间；醇溶性蛋白仅占1.06%，等电点为4.2，蛋白亚基主要分布在12 kDa和20 kDa附近。

(3)过敏原分布显示，过敏原相对含量最高的是醇溶性蛋白，为25.64%，共检出8种过敏原；其次为碱溶性蛋白，过敏原相对含量达到17.93%，检出12种过敏原；不溶性蛋白中仅检出3种过敏原，相对含量为9.86%；水溶性蛋白和盐溶性蛋白过敏原相对含量较低，分别为1.33%和1.21%。考虑到食品安全问题，在食品应用中过敏原含量低的水溶性蛋白和盐溶性蛋白有直接添加的可能；不溶性蛋白经过充分碱洗后，可以作为食品加工过程中用于改善产品功能特性的添加物使用；醇溶性蛋白和碱溶性蛋白必须经过脱敏处理才能进行进一步的开发与利用。