基于聚酰胺—胺树枝状聚合物的牙体硬组织仿生再矿化的研究进展

向科臻 陈亮 杨德琴

重庆医科大学附属口腔医院 口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室

重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147

人牙硬组织的形成是典型的生物矿化过程，即在有机基质模板诱导下的晶体的成核、生长、聚集以及取向[1-2]。基于此“有机基质调控理论”，在近年来仿生矿化的研究中，人们逐渐认识到有机大分子是生物矿化和仿生合成的核心，生物材料的分子仿生设计也随之成为了现代硬组织修复材料设计的主导思想。采用有机模板诱导牙体组织仿生矿化的主要过程如下：先形成有机物的自组装体作为矿化模板，随后无机先驱物在自组装聚集体与溶液相的界面处发生化学反应，再由有机模板调控无机晶体的成核、生长、取向、形态、大小和显微结构[3-4]。仿生矿化的关键是寻找可诱导和调控晶体形成与生长的有机物模板，尽管提取天然釉原蛋白用于人牙釉质表面再矿化的效果值得肯定，但人体内的矿化基质提取成本较高且容易受pH值、氟浓度等环境改变影响[5]，因此是否能发现或合成与之功能相仿的人工替代物成为了近年来的研究热点[6]。

聚酰胺—胺树枝状聚合物（polyamidoaminedendrimer，PAMAM）就是其中之一，其具有天然非胶原蛋白相似的形态和功能特点，被称之为“人工蛋白”[7]。20世纪80年代初，Tomalia等[8]通过反复加成反应首次发明合成了PAMAM（以乙二胺或氨为引发核，聚合反应由引发核向外逐级发生）。PAMAM不仅具有三维结构、高度支化、分子内部空腔和表面基团易于改性等特点，还具有良好的生物相容性、低毒性和无免疫源性，是目前研究最为广泛的树枝状聚合物之一[9-10]。这些特点使PAMAM可以被用作仿生大分子，模拟天然有机基质在牙体组织表面进行仿生矿化，即PAMAM作为有机模板调控矿物质成核以及晶体的生长，以此来建造比传统的异体材料更加理想的牙体修复材料。已有越来越多的研究开始将PAMAM应用到牙体硬组织仿生矿化中，并取得了值得关注的结果。本文旨在对近年来PAMAM在牙科方向上仿生矿化的研究进行综述，为今后的研究工作垫定基础。

1 PAMAM与牙体硬组织仿生再矿化

PAMAM在模拟生物矿化方面有巨大潜能，然而其在牙体硬组织仿生矿化中的作用机制尚不明确。推测牙本质脱矿导致胶原-COOH末端暴露在空气中，随后在肽键凝聚剂作用下，裸露的-COOH末端与PAMAM的-NH2端结合，形成酰胺键（-CO-NH-）接枝有机蛋白，成为仿生矿化的有机控制模板。

Jia等[11]通过扫描电子显微镜观察到，脱矿牙本质经第4.0代PAMAM（G4-PAMAM）处理后的超微结构改变，矿化液中浸泡8周后，牙本质管口被一层扁平、环形的晶状沉积覆盖，部分阻塞了牙本质小管，与去离子水处理的空白组相比，PAMAM组小管的直径和数目均显著减少，意味着可减缓牙本质内液体的快速流动。G4-PAMAM具有治疗牙本质过敏症的潜在价值[11-13]。林轩东[14]通过Pramanik水化学反应制备的聚酰胺-胺/纳米羟磷灰石（polyamideamine/nano-hydroxyapatite，PAMAM/n-HAP）纳米复合生物材料，也具有同样作用。尽管PAMAM诱导牙本质小管封闭速率慢于脱敏剂中常用的NaF，但在28 d后获得了同样效果，且具有更强的耐酸性，意味着其后期封闭效果更加稳定[15]。

PAMAM的再矿化作用不仅可用于治疗牙本质过敏症，还可以用于龋坏、酸蚀、机械作用等原因导致的缺损牙体的修复， Zhou等[16]探讨了三氯生负载的PAMAM-COOH树状大分子在人牙本质上的应用，结果显示PAMAM不仅能够作为药物载体吸附于牙本质表面，而且在局部释放抗菌药物的同时可作为仿生矿化的有机模板剂修复损伤牙本质，该结果提示了PAMAM在龋病修复材料方面也具有广阔的应用前景。

以PAMAM为模板研究牙体硬组织仿生矿化的过程中，改性后的PAMAM具有的多功能性逐渐引起了学者关注。虽然近年来越来越多的研究证实了在代数、表面基团、浓度以及作用时间等条件差异下， PAMAM始终在牙体硬组织表面具有形成晶体修复层的能力，并给出了一定的解释及推测，但由于HAP矿物晶体的成核和结晶过程非常复杂，因此该影响机制还未有明确且公认的解释。

学者[17-18]研究发现，携带不同官能团的PAMAM，如端羧基PAMAM（PAMAM-COOH）、端羟基 PAMAM（PAMAM-OH）、端氨基 PAMAM（PAMAMNH2）均可吸收牙本质胶原纤维中的 Ca、P离子并作为牙本质仿生矿化模板，扫描电子显微镜观察到经过14 d人工唾液浸泡后，G3-PAMAM-COOH处理的牙本质纤维表面清晰可见无定形磷酸钙纳米球，G4-PAMAM-COOH处理的牙本质形成“玉米芯”状外观，至28 d时牙本质表面覆盖新生矿物，小管几乎完全被阻塞，证明牙本质纤维间、纤维内有大量矿物质沉积；与之相比，去离子水处理的空白组牙本质管内、外均无明显矿化，管周胶原纤维呈扁平状，表明由于纤维内矿物支持不足导致脱水收缩[2]。

釉质与牙本质虽然矿物组成相似，但釉质中碳酸盐含量更低（约为3%），因而釉质晶体体积大，孔隙度低，耐酸性较好[19]。目前鲜少有报道将PAMAM用于釉质的仿生矿化。Zhang等[20]通过G4.5-PAMAMCOOH在人牙釉质中的实验形成了定向良好且类似于釉柱的棒状晶体，其自组装过程与釉原蛋白相似，即纳米球-链-微带结构[21]，并通过人牙釉质在体外以及小鼠口腔环境中的实验证实磷酸端PAMAM（PAMAM-PO3H2）也有同样作用，且再生矿物层的厚度均大于10 μm。磷酸基团与羧基基团相比，不仅对Ca离子有更强的络合能力，与羟磷灰石（hydroxyapatite，HAP）结合能力也更强[22]，推测其原因为磷酸端 PAMAM 和牙本质磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）相似度更高，磷蛋白不仅是牙本质基质中最丰富的非胶原蛋白，且磷蛋白的磷酸化程度可以调控其与HAP的相互作用，进而对HAP的成核和生长产生不同程度的作用[23]。Zhu等[24]用磷酸端基的PAMAM负载芹菜素成功诱导牙本质仿生矿化的同时，对变异链球菌也起到了明显的抗菌作用，该策略为临床抗龋修复材料的设计提供了思路。

2 PAMAM复合材料在牙体硬组织仿生修复中的研究

近年来与PAMAM有关的生物复合材料因同时具有有机材料和无机材料的优点而成为了牙体修复材料领域新的研究热点。研究发现，在更贴合实际口腔环境的循环人工唾液/乳酸模型中，PAMAM的仿生矿化效果比以往使用恒定pH值7的研究要弱得多[25]，之后研发出了PAMAM-无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate，NACP）复合材料，认为其有提供成核模板、酸中和、钙磷离子释放等三重好处，可实现促进再矿化和预防脱矿的双重效果，但随着浸泡时间的增加，NACP释放的钙、磷逐渐减少，此外浸泡液的冲刷也可能洗掉PAMAM[26-27]。为了开发一种在流体冲击下依然能维持长期再矿化的方法， Liang等[28]首先对涂布PAMAM的样本进行72 d的PBS浸泡和振荡，建立了一个模拟口腔中受激作用超过1年的加速流体激发模型，然后用EBPMNACP复合材料（40%EBPM、40%NACP和20%玻璃颗粒，其中EBPM为一种二甲基丙烯酸酯和均苯四酸甘油的复合物）与涂布PAMAM后的脱矿牙本质接触并且经过每日23 h人工唾液浸泡+1 h乳酸浸泡，如此持续35 d。值得瞩目的是，新型EBPM-NACP复合材料的酸中和离子再释放并没有随着反复“充电”和离子再释放循环而降低，证明该复合材料可保持长期钙磷离子释放；且采用这种PAMAM+EBPMNACP策略下的样本矿化程度几乎恢复到了健康牙本质水平。综上所述，由于PAMAM和“可充电”的EBPM-NACP复合材料之间的协同作用，提供了流体冲击下牙齿长期再矿化的可能性，也就意味着能够对牙齿实施长效保护并抑制龋齿的发生。不仅如此，在pH=4的乳酸溶液环境中，G3-PAMAM-COOH与含NACP粘接剂的联合应用仍对牙本质仿生矿化有显著效果，提示其有希望解决牙齿仿生矿化方面口干症和放射性龋这类患者酸性唾液环境且缺乏钙、磷离子的问题[29]。

Ge等[30]研究一种含有G3-PAMAM-NH2和甲基丙烯酸二甲氨基异丙酯的新型防龋粘接剂，实验结果显示其具有较强的抗菌性能和诱导牙本质仿生矿化的能力，意味着可以实现脱矿抑制和再矿化促进的双重效果。

Xiao等[31]研制了一种包含NACP、甲基丙烯酸甲酯（dimethylaminohexadecyl methacrylate，DMADHM）、 2-甲基酰氧乙基磷酰胆碱（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC）和纳米银（silver nanoparticles，NAg）的生物活性多功能复合材料（简称BMC），其中DMADHM、MPC、NAg的添加显著增强了材料的蛋白排斥及抗菌性能，将其与G3-PAMAM-NH2联合应用实现了人牙根部牙本质在循环人工唾液/乳酸环境中最大程度的牙本质仿生矿化，且使其在21 d后恢复到与健康根部牙本质相当的硬度，提示BMC+PAMAM复合材料可作为治疗根面龋Ⅴ类洞的修复手段。值得注意的是，牙本质表面快速的矿物沉积可能会导致一种超矿化现象，从而阻止矿物向牙本质管深层继续沉积。

Vasile等[32]用琥珀酸端基的PAMAM制备了尺寸、大小稳定的金-树枝状纳米复合材料，在模拟体液1.5倍加速矿化模型中验证了该材料同样具有诱导HAP形成的潜力。

尽管以上研究证明了PAMAM与其他无机材料结合引导再矿化的策略有良好的应用前景，然而水溶液中游离的树状大分子并不能促进晶体生长，为了实现牙体硬组织原位仿生矿化，必须提高PAMAM与牙硬组织基质（主要是HAP）之间的结合能力，且该能力可能会对控制晶体形态、尺寸产生积极影响[19]。Chen等[33]使用第7代PAMAM-COOH来探测纳米棒状的釉质的表面电荷阵列，用原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）表征了枝状体在晶体表面的分布情况，发现其沿c-轴方向且有规律的间隔（相距约45 nm）。采用蒙特卡罗方法模拟树枝状大分子与晶体表面的结合过程，计算树状大分子的-COOH基团与釉质晶体表面的结合强度，结果表明，釉质表面和生物蛋白质的电荷在二者结合中起重要作用。同样的实验条件下，氨基端的PAMAM比羧酸端的PAMAM与晶体表面结合能力更强。天然磷灰石的等电点为pH5.6[34]，因此研究假定釉质晶体在pH7.4环境中带负电荷，解释了带正电荷的PAMAMNH2结合能力明显强于PAMAM-COOH的原因，然而不能排除电荷分布图案受到釉质晶体表面有机材料的某种影响，故仍需进一步研究。Wu等[35]合成了一种HAP锚定的胺丁羟磷酸盐（alendronate，ALN）与PAMAM-COOH分子的复合物ALN-PAMAM-COOH，由于HAP与ALN的良好结合力，ALN-PAMAM-COOH能够在人工唾液环境中对脱矿釉质表面进行原位仿生矿化，且大分子难以被磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗脱。不同于目前大多数牙体硬组织仿生矿化实验在人工唾液/模拟体液培养条件下进行，Xie等[36]通过将大鼠脱矿牙本质样本缝合到大鼠双颊的方法，研究G3.5-PAMAM-COOH在大鼠唾液环境中诱导大鼠牙齿矿化的能力，结果表明G3.5-PAMAM-COOH能促进牙本质仿生矿化，且对牙本质小管有较明显阻塞效果。

3 PAMAM的生物安全性研究

近年来牙体硬组织仿生矿化领域的研究表明：PAMAM无论是在矿化调控还是诱导晶体成核方面都具有一定的作用，这些作用与PAMAM的代数及表面基团等相关。但是，PAMAM的毒性也引起了关注。PAMAM作为纳米药物向环境中释放，其浓度可能不断增加，因此不可忽视对其生物学特性的研究。Oliveira等[37]用斑马鱼胚胎作为脊椎动物模型来评估PAMAM的毒性，结果表明G3、G4-PAMAMNH2在斑马鱼胚胎中有部分免疫反应，可能与其毒性有关，G3、G4-PAMAM的半数致死浓度分别为1.8和2.3 mg·L-1。学者[38]提出PAMAM的毒性可能与表面官能团逐代呈指数增长以及-NH2的浓度有关，为了避免PAMAM与细胞的直接接触，可以通过化学盖层的方法介导-NH2的细胞毒性作用（PAMAM的游离-NH2基团与乙酰氯发生反应，生成中性树状大分子），胺封盖处理后的pamamm-g-diazirine粘接剂在小鼠体内毒性降低了一个数量级。此外，也有学者[39]提出树状大分子表面-NH2基团的正电荷与细胞膜脂质双层带负电荷组分间产生的静电作用是影响树状大分子细胞毒性的重要因素，通过胺封盖处理可以有效减少PAMAM-NH2与脂质双层间的反应，从而提升PAMAM作为纳米药物的安全性。

尽管PAMAM及相关复合材料在牙体组织上进行仿生矿化的能力已被证实，然而有关PAMAM聚合物代数、表面基团、浓度及处理时间等因素的具体影响机制尚未有公认明确的解释；再矿化层的物理和化学特性（显微硬度、抗酸、抗力特性等）方面的研究也仅处于初期探索阶段；PAMAM诱导仿生矿化的实验大多是在开放环境中进行的，其在树脂牙本质粘接界面微环境内是否具有相同的诱导脱矿牙本质仿生矿化的作用等，以上这些关键性问题的解决有赖于实验手段的不断提高和更多实验数据的积累。PAMAM在牙科领域展现出发展前景的同时，也需要进行药理学和毒理学筛选，只有通过不断的研究才能正确评价PAMAM作为纳米药物的安全性，这一点对于临床安全用药具有重要意义。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。