知母须根化学成分的研究

2020-01-14郑良超廖振东许凤清吴德玲

中成药 2020年8期

郑良超廖振东张伟黄琪许凤清吴德玲*

（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥230012； 2.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽合肥230012； 3.合肥市第二人民医院，安徽合肥230012）

知母须根为百合科植物知母Anemarrhena as⁃phodeloidesBge.的干燥须根。知母的产地分布较广，在辽宁、内蒙、河北、安徽等省均有分布，主要产地分别为安徽亳州与河北易县，其具有清热泻火、滋阴润燥的功效［1］。目前，从知母中分离得到甾体皂苷类、双苯吡酮类、生物碱［2⁃3］等成分。现代药理学研究表明知母具有保护神经损伤［4⁃5］、抑制血小板血栓形成［6⁃7］、降血糖［8］、抗氧化［9⁃10］等作用。知母的须根十分发达，占总采收量的30%左右，在药用过程中大量被舍弃，研究表明知母须根的药理作用和知母主根基本相同，目前对知母须根的化学成分研究较少。课题组前期研究发现知母须根中含有木脂素、二苯甲酮类等成分，其中部分化合物对H2O2损伤的SH⁃SY5Y 细胞显示出保护作用［11⁃13］。为了更好的综合利用知母须根资源，本实验对其化学成分进行研究，从中得到8 个化合物，其中化合物3～8 均为首次从该植物中分离得到。

1 材料

Bruker ARX-400、-600、AVⅢ-500 NMR 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；SEP LC52 半制备高效液相色谱仪（北京赛普瑞思科技有限公司）；硅胶柱色谱、硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH⁃20 （50 μm，瑞典Ge 公司）；反相材料RP⁃18 （50 μm，德国Merck 公司）；AB⁃8 大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）。甲醇和乙腈为色谱级，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

知母须根采自安徽亳州，由安徽中医药大学刘守金教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena as⁃phodeloidesBge.的须根，凭证标本（201510101）保存于安徽中医药大学天然药物化学教研室。

2 提取与分离

将干燥的知母须根（30 kg）粉碎成粗粉，用70%乙醇渗漉提取，减压浓缩渗漉液得到粗提物（3.5 kg）。将粗提物加水分散，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位和水部位；将萃取后的水部位经AB⁃ 8 大孔树脂柱吸附后，用10%、90% 乙醇洗脱，分别得到流分B1（1.6 kg）、B2（1.4 kg）。

取浸膏B2（1.4 kg）经硅胶柱（200～300目），用二氯甲烷⁃甲醇（100 ∶1～0 ∶1）梯度洗脱，TLC 检识合并得到流分Fr.1～Fr.7。将Fr.1经硅胶柱色谱，用石油醚⁃乙酸乙酯（20 ∶1～1 ∶1）梯度洗脱，TLC 检识合并得到Fr.1.1～Fr.1.4，将Fr.1.2 经HPLC 得到化合物3 （21 mg）、2 （16 mg）。将Fr.1.2.3 经HPLC 得到化合物1（8 mg）。Fr.2 经ODS 柱，依次用30%、60%、90%甲醇洗脱，得到8 个亚组分Fr.2.1～Fr.2.8，将Fr.2.8 经硅胶柱色谱，用流动相二氯甲烷⁃甲醇（100 ∶1～0 ∶1）梯度洗脱，得到Fr.2.8.1～Fr.2.8.8，将 Fr.2.8.1 经制备柱色谱得到 Fr.2.8.1.1～Fr.2.8.1.4，再将Fr.2.8.1.3 经HPLC得到化合物4 （8 mg）。Fr.2.6 经硅胶柱色谱，用流动相二氯甲烷⁃甲醇（50 ∶1～1 ∶1）梯度洗脱，得到Fr.2.6.1～Fr.2.6.4，将Fr.2.6.1 经HPLC得到化合物5 （6 mg）、6 （10 mg）、7 （5 mg）、8（6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色结晶（甲醇）。ESI⁃MSm／z：271.0 ［M ＋H］＋，分子式 C17H18O3。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ： 9.17 （1H，s，7⁃OH），6.98 （2H，d，J＝ 8.2 Hz，H⁃2′，6′），6.88（1H，d，J＝8.4 Hz，H⁃5），6.68 （2H，d，J＝8.2 Hz，H⁃3′，5′），6.39 （1H，dd，J＝8.3，2.4 Hz，H⁃6），6.30 （1H，d，J＝2.2 Hz，H⁃8），4.06 （1H，d，J＝10.6 Hz，H⁃2），3.71 （1H，m，H⁃2），3.65 （3H，s，4′⁃OCH3），2.59 （1H，dd，J＝15.8，4.9 Hz，H⁃4），2.52 （1H，dd，J＝14.0，7.5 Hz，H⁃9），2.42 （1H，dd，J＝13.6，7.7 Hz，H⁃9），2.34 （1H，dd，J＝15.8，8.9 Hz，H⁃4），2.10 （1H，m，H⁃3）；13C⁃NMR （150 MHz，DMSO⁃d6）δ： 69.3 （C⁃2），33.7 （C⁃3），29.6（C⁃4），113.4 （C⁃4a），129.3 （C⁃5），106.7 （C⁃6），154.8 （C⁃7），101.0 （C⁃8），155.5 （C⁃8a），32.6 （C⁃9），130.2 （C⁃1′），129.6 （C⁃2′），115.1 （C⁃3′），158.4 （C⁃4′），115.1 （C⁃5′），129.6 （C⁃6′），54.9 （4′⁃OCH3）。以上数据与文献［14］一致，故鉴定为7⁃hydroxy⁃3⁃ （4⁃methoxy⁃benzyl） ⁃chroman。

化合物2：白色针状晶体（甲醇）。ESI⁃MSm／z： 137.8 ［M⁃H］⁃，分子式 C7H6O3。1H⁃NMR（400 MHz，CDCl3）δ： 9.17 （1H，s，4⁃OH），7.82 （2H，d，J＝8.6 Hz，H⁃2，6），6.98 （2H，d，J＝8.6 Hz，H⁃3，5）；13C⁃NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 123.2 （C⁃1），133.1 （C⁃2），116.3（C⁃3），163.4 （C⁃4），116.3 （C⁃5），131.5 （C⁃6），170.6 （⁃COOH）。以上数据与文献［15］一致，故鉴定为4′⁃hydroxybenzoic acid。

化合物3：无色油状物（甲醇）。ESI⁃MSm／z：150.8 ［M⁃H］⁃，分子式 C8H8O3。1H⁃NMR（400 MHz，CDCl3）δ： 7.95 （2H，d，J＝8.6 Hz，H⁃2，6），6.89 （2H，d，J＝8.6 Hz，H⁃3，5），3.90 （3H，s，1′⁃OCH3）；13C⁃NMR （100 MHz，DMSO⁃d6）δ： 122.2 （C⁃1），132.7 （C⁃2），116.1（C⁃3），163.5 （C⁃4），116.1 （C⁃5），132.7 （C⁃6），168.7 （1⁃CO），52.2 （⁃OCH3）。以上数据与文献［16］一致，故鉴定为methyl 4⁃hydroxybenzo⁃ate。

化合物4：黄色结晶（甲醇）。ESI⁃MSm／z：259.0 ［M⁃H］⁃，分子式C13H8O6。1H⁃NMR （400 MHz，DMSO⁃d6）δ： 7.23 （1H，s，H⁃8），6.78（1H，s，H⁃5），6.30 （1H，s，H⁃4），6.13 （1H，s，H⁃2）；13C⁃NMR （100 MHz，DMSO⁃d6）δ：162.6 （C⁃1），97.6 （C⁃2），164.6 （C⁃3），93.5（C⁃4），157.2 （C⁃4a），151.4 （C⁃4b），102.2（C⁃5），155.8 （C⁃6），144.3 （C⁃7），107.8 （C⁃8），110.8 （C⁃8a），178.6 （C⁃9），101.5 （C⁃9a）。以上数据与文献［17］一致，故鉴定为1，3，6，7⁃tetrahydroxy⁃9H⁃xanthen⁃9⁃one。

化合物5：红棕色无定型粉末（甲醇）。ESI⁃MSm／z： 272.7 ［M ＋H］＋，分子式C16H16O4。1H⁃NMR （600 MHz，DMSO⁃d6）δ： 6.88 （1H，d，J＝9.8 Hz，H⁃6），6.47 （1H，s，H⁃5′），6.15（1H，s，H⁃8′），5.94 （1H，d，J＝9.8 Hz，H⁃5），5.64 （1H，s，H⁃3），3.62 （3H，s，2⁃OCH3），2.60 （2H，m，H⁃4′），2.20 （1H，m，H⁃2′），1.87 （1H，m，H⁃3′），1.83 （1H，m，H⁃3′），1.72 （1H，m，H⁃2′）；13C⁃NMR （150 MHz，DMSO⁃d6）δ： 45.9 （C⁃1），179.9 （C⁃2），101.9 （C⁃3），186.9 （C⁃4），122.9 （C⁃5），151.8 （C⁃6），33.0 （C⁃2′），19.0 （C⁃3′），28.2（C⁃4′），127.7 （C⁃4′a），116.1 （C⁃5′），144.6（C⁃6′），143.7 （C⁃7′），113.6 （C⁃8′），123.9（C⁃8′a），55.8 （2⁃OCH3）。以上数据与文献［18］一致，故鉴定为6′，7′⁃dihydro⁃xy⁃2⁃methoxy⁃3′，4′⁃dihydro⁃2′H⁃spiro［cyclohexane⁃1，1′⁃naphtha⁃lene］ ⁃2，5⁃dien⁃4⁃one。

化合物6：白色不定性粉末（甲醇）。ESI⁃MSm／z： 364.9 ［M＋Na］＋，分子式C16H22O8。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ： 6.60 （1H，s，H⁃2），6.47 （1H，s，H⁃6），5.90 （1H，ddt，J＝6.8，9.9，16.9 Hz，H⁃8），5.05 （1H，d，J＝17.0 Hz，H⁃9），4.99 （1H，d，J＝10.0 Hz，H⁃9），4.57（1H，d，J＝7.0 Hz，H⁃1′），3.70 （1H，s，5⁃OCH3），3.21 （2H，d，J＝6.8 Hz，H⁃7）；13C⁃NMR （150 MHz，DMSO⁃d6）δ： 134.7 （C⁃1），107.4 （C⁃2），147.9 （C⁃3），129.6 （C⁃4），145.6 （C⁃5），110.0 （C⁃6），40.4 （C⁃7），137.8（C⁃8 ），115.5 （C⁃9 ），102.8 （C⁃1′），73.3（C⁃2′），75.9 （C⁃3′），69.7 （C⁃4′），77.2（C⁃5′），60.7 （C⁃6′），55.8 （5⁃OCH3）。以上数据与文献［19］一致，故鉴定为michehedyoside D。

化合物7：白色不定性粉末（甲醇）。ESI⁃MSm／z： 334.7 ［M＋Na］＋，分子式C15H20O7。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ： 7.10 （1H，d，J＝8.4 Hz，H⁃5），6.68 （1H，d，J＝2.2 Hz，H⁃2），6.60 （1H，dd，J＝2.2，8.4 Hz，H⁃6），5.90（1H，ddt，J＝6.8，9.9，16.8 Hz，H⁃8），5.04（1H，dd，J＝1.2，16.9 Hz，H⁃9），5.00 （1H，dd，J＝0.8，10.0 Hz，H⁃9），4.59 （1H，d，J＝7.1 Hz，H⁃1′），3.26 （2H，d，J＝6.6 Hz，H⁃7）；13C⁃NMR （150 MHz，DMSO⁃d6）δ： 134.6 （C⁃1），117.2 （C⁃2），147.0 （C⁃3），143.7 （C⁃4），116.1 （C⁃5），119.0 （C⁃6），38.8 （C⁃7），137.9（C⁃8 ），115.4 （C⁃9 ），102.8 （C⁃1′），73.3（C⁃2′），77.2 （C⁃3′），69.8 （C⁃4′），75.9（C⁃5′），60.8 （C⁃6′）。以上数据与文献［20］一致，故鉴定为demethyleugenol α⁃D⁃glucopyranoside。

化合物8：棕色油状（甲醇）。ESI⁃MSm／z：296.1 ［M ＋NH4］＋，分子式C15H18O5。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ： 7.95 （d，1H，J＝9.4 Hz，H⁃4），7.53 （d，1H，J＝8.6 Hz，H⁃5），7.03 （d，1H，J＝8.6 Hz，H⁃6），6.23 （d，1H，J＝9.4 Hz，H⁃3）；13C⁃NMR （150 MHz，DMSO⁃d6）δ： 160.6 （C⁃2），112.5 （C⁃3），144.7 （C⁃4），116.1 （C⁃4a），126.9 （C⁃5），107.9 （C⁃6），160.4 （C⁃7），112.1 （C⁃8），153.1 （C⁃8a），25.0 （C⁃1′），76.2 （C⁃2′），71.9 （C⁃3′），25.5（C⁃4′），25.6 （C⁃5′），56.2 （7⁃OCH3）。以上数据与文献［21］一致，故鉴定为2′，3′⁃dihydroxyl⁃osthole。