HSCCC 分离天然产物中化学成分研究进展

梁元昊 徐文丽 胡瑞雪 刘玉峰

（1.辽宁大学药学院， 辽宁沈阳110036； 2.辽宁省天然产物制药工程技术研究中心， 辽宁沈阳110036）

从天然产物（包括瓜果蔬菜、酒渣酱料） 中分离制备活性有效成分并将用于疾病治疗，正受到越来越多人的重视，但上述成分种类过多，故对其提取分析是一个非常复杂的过程［1⁃2］。天然产物的传统分离方法存在纯度低、分离不彻底、样品变性等问题，从而阻碍了对有效化学成分性质的研究［3］，故如何对其进行分离，进而实现资源深度利用，得到高产率、高纯度活性物质是当前重点。

高速逆流色谱（HSCCC） 是由美国国立卫生研究院Ito博士在20 世纪80 年代最先研制一种独特的液⁃液分配色谱法，它将分析物分配成2 种互不相溶的液体，被分离组分在该溶剂系统中具有不同的溶解度，进而产生分配系数差，使目标化合物能依次被流动相洗出，从而实现组分分离，已广泛地应用于创新药物、植物提取、保健品、天然产物、化妆品等行业中［4⁃5］。本文对HSCCC 在天然产物活性小分子分离、多肽和蛋白质等生物大分子分离、手性分离方面进行概述，以期为分离纯化高产率、高纯度有效化学成分提供一种新的分析方法与思路。

1 HSCCC 概述

1.1 优缺点 HSCCC 不需要固定载体作为固定相，可大容量负载，具有高标本负载能力和目标分析物的高回收率［6］；与柱色谱法、HPLC 制备方法相比，它进一步放大了分离、制备过程，避免了常规分离方法可能导致在分离、纯化阶段由于不可逆的吸附而损失活性成分或分解的问题；能轻松有效地分离具有相似骨架和极性的组分［7］。但该方法在溶剂体系的选择和优化方面，尚无更充分的理论依据，需要根据主观经验进行多次实验，进而筛选出较佳的溶剂系统，有一定的随机性和繁琐性；分离效果易受到两相密度差［8］、温度、体积流量、转速等因素的影响［9］；消耗溶剂过多，一次分离时间过长（以小时计）［10］；制备分离量还不能达到公斤级的分离纯化［11］，故仍需要进一步改进与完善。

1.2 溶剂体系选择 在使用HSCCC 分离天然产物活性成分时，最大的问题是如何选择一个正确的溶剂系统，对其筛选可占总分析时间的90%［12］。HSCCC 两相溶剂体系较稳定，溶剂系统分层时间主要分成3 类，疏水性溶剂体系通常为5～16 s，亲水性溶剂体系一般为38～59 s，中性溶剂体系为19～29 s［13］，一般条件下，溶剂系统不会引起样品的分解、变性，而且其溶解度较高，故目标化合物在两相溶剂系统中分配系数的选择范围要恰当，一般在0.5～2之间［14］。由此确定，HSCCC 溶剂系统［15］在强极性溶剂体系中常用双水相，如正丁醇⁃水、乙酸乙酯⁃水；中等极性溶剂体系中主要是氯仿⁃水、乙酸乙酯⁃水，可在此基础上添加正丙醇、甲醇、异丙醇、正己烷、正丁醇等来调配比例；对于弱极性溶剂体系，可采用正己烷⁃水、石油醚⁃水、三氯甲烷⁃水基本体系，同时添加乙酸乙酯、甲醇进行调配。此外，无水溶剂体系也是理想的选择，由于其不含水，故回收溶剂较方便，而且样品后处理更便捷，节约了成本，目前应用最广泛的是正己烷⁃乙腈体系，采用乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷对其进行调配［16］。

2 应用HSCCC 分离化学成分

2.1 天然产物活性小分子 天然产物主要化学成分包括生物碱、苷类、黄酮、蒽醌、甾体、萜类、香豆素、挥发油、酚类、植物色素类、糖类、脂类等［17］，并且不同种类化合物的药理作用也有所差异［5］。

2.1.1 多酚 多酚是食品中最丰富的抗氧化剂，富含该成分的天然产物或饮料都与预防某些慢性疾病（如癌症和心血管疾病） 有关［18］。HSCCC 是一种全液相色谱系统，它在一定程度上消除了多酚的分离过程中的不可逆吸附和尾影形成［19］，主要采用2 种溶剂系统，当多酚分子量较小时，主要采用中等极性溶剂，如氯仿⁃甲醇⁃水、正己烷⁃水⁃甲醇⁃乙酸乙酯等［20］；当其分子量较大时，主要采用正丁醇⁃水等极性较强的溶剂体系［21］，具体应用时可适当对溶剂进行调整。

Peng 等［22］在最优条件下采用正己烷⁃乙酸乙酯⁃水（3 ∶17 ∶20）、乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（50 ∶1 ∶50） 溶剂体系，通过两步分离成功地从柿子中得到出7 种主要多酚，纯度均高于95.0%，并且发现HSCCC 在制备二聚原花青素方面具有明显的优势。Kohler 等［23］将葡萄籽提取物黄烷⁃3⁃醇间苯三酚加合物在乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（1 ∶5 ∶0.1 ∶5、1.5 ∶10 ∶1.5 ∶10） 体系下直接用HSCCC 全液相色谱技术进行分离，发现所得馏分中含有纯度极高的化合物，实现了对二聚体到四聚体原花青素的分离。此外，HSCCC 分离低聚原花青素时已证实可应用于半制备规模上，在某些情况下可采用制备型高效液相色谱法进行最终纯化。Jiang 等［24］建立了一种简便、快速、峰容量显著提高的离线二维HSCCC，分别以正己烷⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（3 ∶5 ∶3 ∶5）、乙酸乙酯⁃正丁醇⁃水（7 ∶3 ∶10） 为第1、第2 维两相溶剂体系，成功从苦荞粗提物中分离出槲皮素3⁃O⁃芦丁苷、芦丁、山柰酚⁃3⁃芦丁苷、槲皮素、山柰酚，纯度均在96%以上，可为苦荞新制剂、功能性产品开发及进一步生物测定提供理论依据。Wen 等［25］采用HPLC⁃HSCCC 联用技术，以氯仿⁃甲醇⁃水⁃正丁醇（4 ∶3 ∶2 ∶1.5） 为溶剂从山楂叶中分离得到4 种黄酮，纯度均在98%以上。

2.1.2 生物碱 Sutherland 等［26］报道了通过HSCCC 分离纯化天然产物有效成分的研究概况，涵盖了来自56 个科、108 种植物，从中分离了354 个化合物，其中关于生物碱的文献有56 篇，占化合物总数的16%。Guo 等［27］将HSCCC 与HPLC⁃DAD⁃QTOF⁃MS／MS 分析相结合，选择石油醚⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（8 ∶4 ∶7 ∶5） 作为溶剂体系来分离厚朴粗提取物，并将2 种主要木脂素、厚朴酚剔除后，对生物碱等微量成分进行富集，再通过保留时间、UV、准分子离子、裂解途径结合比对标准品或已知化合物，初步确定了其结构。Zou 等［28］采用重结晶法预处理芦荟乙醇提取物，以正己烷⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（5 ∶2 ∶5 ∶3） 为溶剂一步合成了3 种喹诺酮类生物碱｛1⁃甲基⁃2 ［（6Z，9Z） ⁃十五碳二烯基］ ⁃4 （1H） ⁃喹诺酮、二氢玫瑰碱、1⁃甲基⁃2⁃十五烷基⁃4 （1H） ⁃喹诺酮｝，然后以5 ∶3.5 ∶8.75 ∶8.25 比例从各亚组分中又分离出3 种喹诺酮类生物碱［1⁃甲基⁃2⁃十一烷基喹啉⁃4 （1H） ⁃酮、（Z） ⁃1⁃甲基⁃2⁃ （十三碳⁃5⁃烯⁃1⁃基） 喹啉⁃4 （1H） ⁃酮、1⁃甲基⁃2⁃壬基喹啉⁃4 （1H） ⁃酮］。刘德明等［29］采用HSCCC 对正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇、丙酮、水等溶剂进行搭配组合以筛选溶剂体系，发现石油醚⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（5 ∶1 ∶2 ∶4） 分离生物碱类的效果最佳，并从黄柏粗提物中分离得到小檗碱、黄柏碱、巴马丁和白瓜蒌碱，纯度均可达95%以上。

2.1.3 皂苷 由于苷分子中所连糖基较多，极性较大，以固体为载体的传统方法对其分离时易造成死吸附，HSCCC技术被证明是分离此类物质的理想方法，对降低分离提取成本、提高产品质量有重要的意义［30］。在分离极性较小的单糖苷时，主要采用醋酸乙酯⁃甲醇⁃水、氯仿⁃甲醇⁃水、正己烷⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水溶剂体系，并可通过调节其比例来进一步分离不同极性者［31］；对于极性较大的双糖苷或多糖苷，大多采用醋酸乙酯⁃正丁醇⁃水，通过调节正丁醇用量来进一步分离不同极性者［32］，但这并不是绝对的，一般是根据前人经验来进一步巧妙地缩短分离时间和步骤。

Du 等［33］发现，HSCCC 是一种在实验室规模上分离三萜糖苷的有效方法，可用于制备苦瓜中纯三萜皂苷，首先通过硅胶柱层析法从粗提物中得到2 种三萜皂苷，进而使用不同比例甲基叔丁基醚⁃正丁醇⁃甲醇⁃水溶剂体系作进一步分离纯化。Ma 等［34］以正丁醇⁃乙酸⁃ 6 mmol／L 醋酸铵水溶液（4 ∶1 ∶5） 为溶剂体系，采用HSCCC⁃ELSD 技术，成功地从大蒜粗提液中一步分离纯化出4 种甾体皂苷，从300 mg 粗品中分离得到4 个化合物，纯度可达93.0%以上，这也是上述联用技术首次用于分离和纯化该类成分。

2.1.4 其他 HSCCC 已被用于纯化足量的抗微生物化合物，用于测定天然抗菌化合物的抑制谱和作用方式［35］。Liang 等［36］将HSCCC 作为羟基不饱和脂肪酸的纯化方法，可获得足够量以研究对菌丝体真菌、分生孢子、酵母的抑制谱。Wu 等［37］将HSCCC 与超临界萃取相结合，以正己烷⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（7 ∶3 ∶8 ∶2） 为溶剂体系，成功提取分离了山苍子中对甲氧桂皮酸乙酯和肉桂酸乙酯，两者纯度分别为98.4%和98.1%，有效解决了由于常规分离技术中精力、溶剂消耗大，样品、对照品损失多的问题。Wei等［38］引入HSCCC 来纯化番茄红素，以正己烷⁃二氯甲烷⁃乙腈（10 ∶3.5 ∶6.5） 为非水溶剂体系，得到了纯度高于95%的该成分。Zou 等［39］建立了一种基于三相溶剂体系液⁃液萃取和HSCCC 来快速富集蟾蜍肉中微量丁二烯内酯4 个差向异构体的方法，首先选择响应面法优化后的正己烷⁃乙酸甲酯⁃乙腈⁃水（3 ∶6 ∶5 ∶5） 溶剂体系对粗提液进行液⁃液萃取，再用氯仿⁃甲醇⁃水（4 ∶2 ∶2） 溶剂体系进行富集，有助于蟾蜍肉的定量分析和安全性评价。

2.2 多肽、蛋白质等生物大分子 蛋白质作为天然产物中的第一大营养素，对生物体内的生命活动起着重要作用，基于此，由其降解得到的生物活性多肽也引起了人们广泛关注。HSCCC 主要采用双水相溶剂系统和含有丁醇的体系来用于蛋白质、多肽的前处理，对复杂样品粗分时再通过其他分离技术来得到高纯度样品［40］，但由于溶剂体系比较单一，难以达到完全分离的条件，所得成分的种类也有限，导致该技术局限于简单二肽、中极性或弱极性的肽类衍生物的分离［41］。因此，基于HSCCC 分离蛋白质和多肽的分析主要集中于其标准品分离，以便于研究仪器分离效率与机理，从而进一步实现中试放大［42］。

Li 等［43］使用HSCCC 结合反胶束溶剂系统，开发了一种从苦瓜果实中分离蛋白质的新方法，这也是首次在苦瓜中发现该成分。另外，HSCCC 在分离蛋白质等大分子时，由于有机溶剂会使生物大分子及细胞发生不可逆的结构和性质改变，故通常选用双水相体系［44］。郅文波等［44］采用多分离柱高速逆流色谱研究聚乙二醇1000⁃磷酸盐双水相体系的固定相保留率，以及该体系对蛋白质混合物和鸡蛋清的分离效果，发现pH 为9.2 时细胞色素C、溶菌酶、血红蛋白的分配系数差异最大，在体积流量10 mL／min、转速850 r／min 的条件下成功地分离了鸡蛋清，得到了卵白蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白。

2.3 天然产物手性分子 在分离天然产物手性分子中的单体化合物时，由于异构体分子性质不同，通常只有一种异构体具有较强生物活性，而另一种基本无活性或活性较弱，或具有不同药理活性甚至毒性［45］，如何从中分离得到单一的异构体是急待解决的问题。随着高效手性添加剂的发现和逆流色谱仪器的进一步完善，近年来HSCCC 在相关方面已经得到了成功应用。通过HSCCC 分离羧酸、糖苷、萜类生物碱等异构体时，主要使用乙酸乙酯⁃水、正丁醇⁃水等强极性体系；分离多酚、苯丙类、苷类、芳香酸等异构体时，大多采用甲基叔丁基醚⁃水、正己烷⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水等中等极性体系。此外，还可采用逆流色谱闭路循环、多重双向洗脱模式等多样化洗脱模式适当提高异构体分子间的色谱分离度［46⁃47］。

2.3.1 立体异构 儿茶素、表儿茶素互为构象异构体，均属于黄烷醇多酚类化合物，但对两者大量制备分离方法的研究报道较少。成超等［48］采用HSCCC 实现了2 种成分的完全分离，在120 min 内以正己烷⁃乙酸乙酯⁃水（1 ∶20 ∶20） 为溶剂系统，得到了两者纯度分别在99%、95%以上，同时在柱体积放大约6 倍的情况下可获得上样量放大50 倍的理想制备分离效果，这正是该技术的优势所在［48］。段文娟等［49］采用乙酸乙酯⁃正丁醇⁃甲醇⁃水（5 ∶0.7 ∶1 ∶5）、乙酸乙酯⁃正丁醇⁃甲醇⁃水（5 ∶0.5 ∶1 ∶5） 作为溶剂体系，从连翘果实中分离制备了2 对木脂素类立体异构，即（＋） 松脂醇单甲醚⁃β⁃D⁃葡萄糖苷和连翘苷、（＋） 松脂醇⁃β⁃D⁃葡萄糖苷和（＋） 表松脂醇⁃4′⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷。

2.3.2 构造异构 在HSCCC 一步法分离过程中，有时很难找到理想的高纯度溶剂体系，制备高效液相色谱法（prep⁃HPLC） 常作为额外的分离步骤来实现HSCCC 和HPLC 之间的互补作用［50］。在大黄蒽醌糖苷传统的分离过程中，通过二氧化硅、凝胶色谱法分离大黄酚1⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷、大黄酚8⁃O⁃β⁃D葡萄糖苷2 种异构体时存在很大的困难，Chen 等［51］通过prep⁃HPLC 结合HSCCC 成功分离了两者。孙文宇等［46］开发了大孔树脂⁃洗脱⁃推挤逆流色谱法，以正丁醇⁃乙酸乙酯⁃水（2 ∶3 ∶5） 为溶剂体系从30%白芍乙醇提取物中分离得到了芍药苷和芍药内酯苷，再采用洗脱⁃推挤逆流色谱和普通逆流色谱，以正己烷⁃乙酸乙酯⁃甲醇⁃水（0.5 ∶5 ∶1 ∶5） 为溶剂体系，从其95% 提取物中分离得到苯甲酰芍药苷、6′⁃O⁃苯甲酰芍药内酯苷，纯度均高于95%。

3 结语

国内外关于从天然产物中分离纯化单体化合物的工艺优化过程报道较少，基本上仍停留在溶剂提取、常压柱色谱水平，传统分离方法对含有量低、结构和性质相似、不能结晶组分的分离提纯常受到限制，存在固态载体吸附损耗、样品变性、回收率低等问题。HSCCC 可在短时间内实现高效分离和分析，具有无固体载体、避免分离样品与固体载体表面产生化学反应而变性、不可逆吸附等优点，而且对样品预处理要求较低，适用于粗提取物分离，从而提供了更便捷、更有效、产率和纯度更高的提取方法，极大地减少了昂贵标准品购买成本及样品制备富集负担。但该技术在溶剂体系的选择和优化方面尚无更充分的理论依据，只能根据经验来减少实验次数，进而筛选出较佳的溶剂系统，故仍需要继续探索如何能在此基础上进一步创新，使其逐渐发展成一种应用更广的色谱技术。