Tim-3抗肿瘤免疫的研究进展①

董 頔 陈志芳

(新疆医科大学第一附属医院,乌鲁木齐 830054)

免疫细胞和分子是肿瘤生物学的关键调节点，具有支持或抑制肿瘤发展、生长、侵袭和转移的能力。肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而得以在体内生存和增殖的现象[1]。近年来，针对肿瘤免疫逃逸机制进行的癌症免疫疗法取得了令人瞩目的临床效果[2，3]。程序性死亡受体(programmed cell death protein 1，PD-1)作为免疫抑制分子，在肿瘤免疫逃逸机制中发挥着重要作用[4]。尽管针对PD-1的检查点阻断策略取得了成功，但大部分癌症患者尚未从这种新疗法中获益[5]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)已被发现在传染病、自身免疫疾病和肿瘤小鼠模型中介导免疫耐受[6-8]。Tim-3作为癌症免疫疗法的潜在候选因子已经获得突出地位，并且已经证明Tim-3与其他检查点抑制剂的体内阻断增强了抗肿瘤免疫力并抑制了几种临床前肿瘤模型中的肿瘤生长[8-10]。

1 Tim-3的分子结构

Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)在人和小鼠的多种免疫细胞类型中表达。小鼠的Tim-3由281个氨基酸残基组成，而其人类同源物由302个氨基酸残基组成，与小鼠Tim-3具有63%的同源性[11]。Tim-3属于免疫球蛋白超家族(IgSF)，包括膜远端免疫球蛋白(IgV)结构域、胞浆区、跨膜区、黏蛋白区和信号肽区。其中胞浆区主要功能是参与信号传递，决定下游信号通路的传导，IgV结构域与适当配体的结合对于Tim-3的免疫调节具有重要作用，有助于诱导外周耐受和抑制抗肿瘤免疫[12]。与跨膜结构域相邻的Tim-3细胞质尾部含有5个酪氨酸残基的保守区域，其中两个对于偶联到下游信号传导途径至关重要[13]。这两个酪氨酸残基的肽序列在人和小鼠之间高度保守，并且作为SH2结构域结合基序起作用。含SH2结构域的激酶许多是T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号通路的关键组成部分，说明Tim-3和TCR通路之间存在功能关系[14]。

2 Tim-3的配体

2.1Galectin-9 关于Tim-3配体，最初鉴定了两种细胞膜外相关蛋白，其分子量分别约为35 kD和60 kD，并与Tim-3IgV结构域结合。分子量为35 kD的细胞膜外相关蛋白在生物化学上被表征为C型凝集素Galectin-9[15]。Galectin-9是一种含有两个串联碳水化合物识别结构域的可溶性蛋白质，特异性识别Tim-3 IgV结构域中N-连接糖链的结构，但不识别Tim-2和Tim-4等Tim家族蛋白质[16]。与Tim-3 IgV结构域和其他半乳糖凝集素(包括半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-4)的相互作用相比，Tim-3IgV结构域和Galectin-9之间的结合具有最高亲和力，表明Galectin-9和Tim-3之间存在特异性结合的相互作用[17]。Galectin-9和Tim-3之间的相互作用引发Th1细胞死亡，从而抑制组织产生炎症反应，减少自身免疫疾病的发生[18]。相同的，Galectin-9还诱导结肠癌Tim-3+CD8+TIL的凋亡[19]。然而，因为Galectin-9被发现可增加Tim-3介导的NK细胞系中IFN-γ的产生，所以并非所有Galectin-9-Tim-3相互作用都会导致细胞死亡[20]。在人类THP-1骨髓细胞中，Galectin-9激活Tim-3介导的PI3KmTOR信号传导通路而不诱导细胞凋亡[21]。

Galectin-9和Tim-3在单核细胞/巨噬细胞上的相互作用可能会导致细胞因子的产生改变，其通过改变IL-12和IL-23的产生从而影响Th1或Th17的应答[22]。

Tim-3与Galectin-9之间存在反向作用。小鼠结核病模型的研究表明，Tim-3通过小鼠和人类细胞中Galectin-9依赖性机制，对诱导IL-1β的产生和增强巨噬细胞中的抗分枝杆菌活性非常重要[23]。研究发现，Tim-3 T细胞转基因CD4+T细胞控制Galectin-9阳性的巨噬细胞中的结核分枝杆菌复制，进一步证实了Tim-3-Galectin-9反式相互作用介导的负性信号对于巨噬细胞中的抗结核分枝杆菌活性至关重要[24]。这种负性信号通路在控制感染者的结核分枝杆菌生长方面起着重要作用，这些人T细胞上Tim-3的表达会增加。总的来说，Tim-3反向作用于Galectin-9，使Th1和Tc1控制细胞内病原体来清除被感染的巨噬细胞[25]。IFN-γ诱导Galectin-9表达可促进巨噬细胞内病原体的清除，同时确保T细胞上的Tim-3分子不会对Th1细胞应答产生克隆增殖[26]。

2.2Ceacam1 第二个被发现的Tim-3配体是癌胚抗原细胞黏附分子1(Ceacam1)，其分子量约为60 kD[27]。Ceacam1膜远端Ig V区是一种高度保守的结构，与Tim-3的Ig V区具有结构相似性，并且沿着它们的FG环相互作用，研究者们推测这就是配体的结合位点[28]。当Ceacam1过表达时，可以显著增强 Tim-3 分子的负性免疫调控功能，并且在没有Ceacam1表达的情况下Tim-3的抑制功能会被削弱[27]。此外，Ceacam1-Tim-3反式相互作用会抑制效应T细胞功能，并且对维持T细胞耐受是必需的[29]。Galectin-9和Ceacam1分别与Tim-3的Ig V区中的不同区域结合，均会导致细胞质尾部释放Tim-3信号通路抑制性调节剂Bat3这样的下游效应发生[30]。因此，这两种配体可能在调节Tim-3信号传导中具有协同作用。

2.3HMGB1 高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)作为Tim-3配体，是一种与损伤相关的分子模式蛋白，可以感知内源性危险信号[31]。HMGB1可以从活化的树突状细胞主动释放，以促进T细胞和B细胞的反应。在树突状细胞中，HMGB1在核酸转运到内体囊泡过程中起关键作用，这是树突状细胞感知肿瘤衍生的应激因子或病原体相关的分子模式的关键步骤，并产生对肿瘤或病原体感染的保护性免疫反应[32]。在肿瘤微环境中，肿瘤浸润性树突状细胞中Tim-3表达水平高于正常组织树突状细胞中Tim-3的表达水平。Tim-3与HMGB1结合以阻断核酸向内体的转运，从而抑制模式识别受体介导的对肿瘤衍生核酸的先天免疫应答[33]。因此，阻断Tim-3介导的核酸感应系统的抑制作用可能会有助于DNA疫苗的开发和化疗用药的进展。有趣的是，Tim-3上的HMGB1结合表位与Tim-3上的Ceacam1结合表位大部分重叠，FG环中的Q62(人类E62)是与HMGB1和Ceacam1相互作用的必需氨基酸残基，由此衍生出了HMGB1和Ceacam1之间潜在竞争性结合Tim-3的问题[34]。

2.4PtdSer 磷脂酰丝氨酸(PtdSer)是Tim-3的非蛋白质配体，与Tim-3 IgV结构域的FG-CC′环结合。 由于FG-CC′环形成的裂缝是所有Tim蛋白共有的特征结构，因此PtdSer也是Tim家族其他蛋白的配体[35,36]。PtdSer与Tim蛋白的结合与凋亡细胞的清除有关[37]。因为T细胞没有清除凋亡小体的作用，所以T细胞中Tim-3-PtdSer的相互作用目前尚不清楚[38]。然而，IL-10与Tim-3阳性的T细胞共表达，所以Tim-3与PtdSer的相互作用可能诱导T细胞产生IL-10。

由于Tim-3 IgV结构域中FG-CC′环存在重叠的结合位点，因此了解Ceacam1、HMGB1和PtdSer如何协调它们与Tim-3的相互作用并调节特异性免疫是非常重要的。

3 Tim-3与肿瘤

3.1Tim-3生物学特性与癌症的关系 Tim-3除了在免疫细胞和肿瘤中的表达升高外，它的遗传多态性也与癌症有关。在中国人的启动子区域(-574G/T，-882C/T，-1516G/T和-1541C/T)和编码区域内鉴定出Tim-3基因的多态性(+4259T/G，氨基酸取代物：精氨酸替换亮氨酸)[39]。携带+4259TG基因型的受试者与对照组相比，患非小细胞肺癌的风险增加2.81倍，且存活时间明显缩短[40]。携带+4259 TG基因型和+4259G等位基因的受试者与对照组相比，胰腺癌患病率显著增加[41]。

3.2Tim-3与癌症预后 多种肿瘤的癌细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TILs)和内皮细胞中均已发现Tim-3的表达[42]。已有充分证据表明，在肿瘤组织样本Tim-3的蛋白水平和mRNA表达水平均升高，并且与前列腺癌、肾透明细胞癌、结肠癌、膀胱尿路上皮癌和宫颈癌患者的预后不良有关[19,43-46]。肿瘤抗原特异性CD8+T细胞中Tim-3表达增加也与CD8+T细胞功能障碍和HBV相关肝细胞癌和前列腺癌患者预后不良有关[43,47]。同样，胃癌患者NK细胞Tim-3表达增加与肿瘤进展有关[4]。因此，人类免疫细胞中Tim-3的表达增加可作为各种肿瘤的潜在预后生物标志物。

3.3Tim-3参与肿瘤T细胞的调节 在不同癌症中进行的研究最终证实Tim-3由于其与肿瘤T细胞耗竭有关而充当抗肿瘤免疫的负调节剂。在晚期黑色素瘤的患者中，有肿瘤-睾丸抗原家族NY-ESO-1抗原特异性表达的Tim-3+PD-1+CD8+T是肿瘤诱导的T细胞中功能高度失调的一种细胞，并且约30%的NYESO-1特异性CD8+T细胞表达Tim-3[48]。同样的，在非小细胞肺癌患者中，近33%的CD8+TILs表达Tim-3[35]。在这些癌症中，Tim-3+T细胞共同表达PD-1并表现出增殖功能和效应细胞因子产生的不足。

最近的研究证明了Tim-3除了具有调节癌症CD8+T细胞效应功能，还在调节人Tim-3+Foxp3+Treg细胞中起到关键作用，肝细胞癌，卵巢癌，结肠癌和宫颈癌中均有Tim-3+Foxp3+Treg细胞的存在[19,46,47,49]。在非小细胞肺癌患者中，约60%的CD4+Foxp3+TILs中表达Tim-3[35]。TILs中Tim-3+Foxp3+Treg细胞的存在与肿瘤淋巴结转移和晚期癌症有关。由于多种临床模型肿瘤组织中发现Tim-3+Foxp3+Treg细胞的存在，进一步证实了Tim-3在Foxp3+Treg细胞中的作用[50]。可能是由于IL-10的表达增加，这些模型中的肿瘤组织表达了比Tim-3-Foxp3+Treg细胞更具免疫抑制性的Tim-3+Foxp3+Treg细胞。在这些模型中，Tim-3+Foxp3+Treg细胞被认为促进了CD8+TIL功能失调。另一种假设表明肿瘤微环境驱动了Foxp3+Treg细胞活化，并且Tim-3表达增加导致了更严重的肿瘤浸润性CD8+T细胞的免疫抑制。

3.4Tim-3调节肿瘤固有免疫细胞 与Tim-3在T细胞上的可诱导性表达相比，在固有免疫细胞上发现了Tim-3的成组性表达。到目前为止进行的大多数体内研究已经确定Tim-3在抗肿瘤固有免疫中起抑制作用[51]。

Tim-3已经被证实在人单核细胞中具有直接抑制作用[52]。它在未刺激的外周血CD14+单核细胞上呈成组性表达，但TLR刺激后，伴随IL-12产生的增加，Tim-3表达水平迅速下降。在通过TLR4/7刺激后，阻断Tim-3会导致单核细胞中IL-12和IL-10的增加。

最近的一项研究表明，Tim-3在肝细胞癌肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)的表达是由包括TGF-β在内的肿瘤衍生信号诱导的[53]。由于可溶性因子如IL-6的分泌，进一步促进了TAM介导的肝细胞癌生长。此外，Tim-3的表达抑制了该模型中肿瘤特异性CD8+T细胞的活化。最近的研究表明M1巨噬细胞具有吞噬、呈递抗原和促炎症细胞因子产生等多种功能，并有助于消除具有Tim-3低表达的癌细胞[54]。这证明了Tim-3在多种细胞类型中的起免疫抑制作用及其在肿瘤微环境中具有调节免疫细胞相互作用的功能。

3.5Tim-3和肿瘤细胞 越来越多的证据表明，Tim-3的表达不仅限于免疫细胞，也在癌细胞上表达，如黑色素瘤、骨肉瘤、宫颈癌和肾透明细胞癌[44，48,55]。最近的两项研究表明，Tim-3在急性髓性白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)中高表达， 但不在正常的造血干细胞(hemopoietic stem cells，HSCs)中表达[56，57]。 由于急性髓性白血病患者同时含有LSCs和HSC，因此Tim-3可作为LSC的标志物监测急性髓性白血病干细胞的产生。此外，还在淋巴瘤上皮细胞上发现了Tim-3的表达。

Tim-3在多种肿瘤细胞中的表达说明了其在肿瘤进展中的潜在作用。研究表明Tim-3可通过不同的机制促进肿瘤进展，包括促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，通过激活IL-6-STAT3途径直接抑制CD4+T细胞以抑制Th1极化，或激活AML细胞中的mTOR功能[58]。

由于Tim-3-Galectin-9负性信号通路对于骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)增殖至关重要， Tim-3在肿瘤细胞上的表达与其在TILs上的表达相似[59]。通过Galectin-9依赖机制形成MDSCs的免疫抑制功能从而在肿瘤免疫逃避中发挥重要作用。因此，需要进一步研究以更好地了解Tim-3介导的免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。

4 展望

越来越多的证据支持Tim-3与人类癌症相关。无论是在实验模型还是在人体中，现在已经确定，Tim-3和PD-1标记多种癌症的功能失调T细胞。此外，在效应T细胞、Treg细胞和固有免疫细胞等多种细胞类型中观察到Tim-3的免疫抑制作用,并且由于Tim-3也在非T细胞中表达，阻断Tim-3可能将肿瘤微环境从免疫抑制状态转变为免疫激活或抗肿瘤状态,以上发现强调了在这些细胞中靶向Tim-3的重要性。由于Tim-3不仅在CD8+T细胞和Foxp3+Treg细胞这两个关键的促肿瘤免疫抑制的免疫细胞上表达，并且在骨髓细胞、NK细胞、癌症干细胞和癌细胞本身也有表达，而且Tim-3与免疫抑制和肿瘤促进作用相关，所以Tim-3是抗癌免疫治疗的一个非常合适的靶向目标。

目前的实验结果说明阻断Tim-3可以提高细胞介导的抗肿瘤免疫反应。此外，Tim-3单克隆抗体可能与其他免疫治疗方式共同作用来增加抗肿瘤治疗的功效。彻底了解Tim-3在各种肿瘤和肿瘤免疫治疗模型中的不同作用，有利于进一步靶向Tim-3的药物开发和设计与PD-1或CTLA-4单克隆抗体的组合疗法。