Treg/Th17平衡介导肿瘤发生的研究进展①

陈甜甜 黄 帅 王 蔚 吴 丽 陆 茵

(南京中医药大学药学院，南京 210023)

炎症在长久以来都是癌症发生发展的重要因素[1]。研究表明，癌症的发生与炎症细胞因子水平和免疫细胞组成结构密切相关。炎症反应参与癌症发展的各个方面，包括细胞增殖和存活、恶性转化、血管生成、侵袭和转移[1]。在炎症组织中，免疫细胞及细胞因子具有防止组织过度损伤的调节作用，当免疫细胞功能失常时则有可能促进“炎癌转化”。 同时癌症免疫学也解释了肿瘤发生发展转向肿瘤微环境中免疫细胞群间潜在的相互作用，包括细胞比例的改变、串扰及免疫细胞表型可塑性变化等研究。在这些免疫细胞中，CD4+T辅助淋巴细胞是免疫反应和炎症疾病的重要调节因素。幼稚CD4+T细胞与固有免疫细胞表达主要组织相容性复合物Ⅱ(major histocompatibility complex，MHCⅡ)结合，通过协同共刺激分子、释放炎症细胞因子等来调节辅助性T细胞(helper T cell，Th)分化[2]。通常Th17的分化由IL-6、IL-1β、IL-23、TGF-β等细胞因子调节，而调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)主要在TGF-β的诱导下分化成为具有调节免疫作用的细胞。本文将深入探讨打破这两种细胞间平衡在肿瘤和慢性炎症组织中及其对肿瘤发生发展的作用。

1 Th17/Treg细胞的生殖功能

生理条件下，Th17主要存在于小肠固有层，但在感染过程中，Th17膜上的TCR受到刺激，分泌的IL-17与细胞膜上含有IL-17受体(IL-17 receptor,IL-17R) 的细胞如内皮细胞、上皮细胞等结合，刺激相应靶细胞活化，在黏膜组织部位诱导炎症反应发生[3]。此外，Th17还能分泌IL-21、IL-22、TGF-β、IL-23等细胞因子，在多种慢性炎症疾病中介导免疫应答。

Treg主要由两个群体组成：胸腺来源的天然Treg(natural Tregs，nTreg)和外周性诱导Treg(inducible Tregs，iTreg)。Treg通过多种途径抑制效应T细胞功能，包括产生免疫抑制的细胞因子，如TGF-β及IL-10，并通过与效应T细胞或抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)等免疫细胞相互作用，在免疫耐受的建立和维持中发挥重要的调节作用[4,5]。nTreg通常出现在外周血中，可以改善移植物抗宿主病反应(graft-versus-host disease，GVHD)和小鼠的自身免疫病。

2 Th17/Treg的生理调控

Th17和Treg均由幼稚CD4+T细胞发育而来，均可由TGF-β诱导分化[6]。但二者的基因转录因子表达不同，其效应功能也不同。通常认为Treg和Th17在免疫调节中起相反作用，其中关键转录因子是控制CD4+T细胞分化成Treg和Th17的决定性因素。人和小鼠研究表明，转录因子叉头盒子P3(forkhead box P3，Foxp3)是Treg发挥免疫抑制功能的关键性转录因子，能够抑制Th17的转录因子维甲酸受体相关孤儿受体γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor γt ，RORγt)和RORα表达，从而促进Treg分化。IL-6、IL-21、IL-23等多种促炎因子和mTOR受体激活均可诱导RORγt表达、促进Th17分化并抑制FOXP3表达。在Treg与Th17分化过程中，新型亚群的发现也为疾病的探索提供重要思路。例如在慢性炎症环境下产生的IL-17+FOXP3+T细胞能同时表达FOXP3并分泌IL-17。多项临床研究发现，在自身免疫性疾病、过敏、肿瘤等多种疾病中，Treg与Th17平衡的改变都预示着疾病的进程及预后情况。

2.1Th17/Treg平衡与肺癌发生 Th17与Treg是介导慢性炎症反应发生的两个主要免疫细胞，Th17与Treg的比例失衡是炎症发展的显著特征。而炎症微环境也被认为是肿瘤发生发展的“温床”。Duan等[7]在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者外周血中发现Th17和Treg数量的改变，提示Th17/Treg失衡可能是肺癌的重要发病机制之一。

2.1.1Th17和肺癌 流行病学研究发现，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者的肺癌发病率更高。COPD的特征为过度炎症和上皮细胞基质破坏[8]。在炎症浸润的肺组织中，Th17分化增多促进IL-17和IL-21分泌，诱导CD8+T增殖，并招募中性粒细胞聚集在炎症部位，从而调节COPD的炎症微环境。同时Th17是肿瘤微环境中浸润的重要免疫细胞，在肺癌的发生发展中发挥促炎作用，提示Th17在COPD向肺癌转化过程中起重要作用。临床研究发现IL-17在肺癌患者血清中表达进一步升高 ，基础研究也证实IL-17家族及其信号通路的改变尤为重要，具体表现在IL-17的基因多态性和相关信号通路的表观遗传学改变能提高肺癌的易感性。Marshall等[9]对COPD的小气道上皮细胞DNA甲基化模式的表观遗传学进行了分析，发现IL-17F炎症反应通路与肺癌的发生显著相关。同时IL-17受体C(IL-17RC)和CXCL1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1]都被证实具有低表达和高甲基化的特点。此外，研究发现慢性过表达IL-17A的转基因小鼠肺中，趋化因子CCL7、CCL22、CCL20、CCL11及CXCL1的表达上调，诱导树突状细胞激活和T细胞募集，持续引起炎症反应，提示IL-17A和IL-17F具有促进炎癌进程的作用。IL-17除了能促进致癌基因甲基化，还有助于诱导肺癌转移前因子表达。外周血检测发现IL-17表达升高与肿瘤淋巴结转移(TNM)分期明显相关[9]。除IL-17外，Th17分泌的IL-22还可直接或间接通过JAK/STAT通路诱导血管生成和肿瘤细胞转移[2]。这些细胞因子分泌及效应细胞的应答对肿瘤前微环境的形成和转移具有促进作用。

2.1.2Treg与肺癌 临床研究发现，COPD患者中Treg亚群(aTreg+rTreg)(抗炎亚群)/FrⅢ(促炎亚群)的比率总体降低，而(aTreg+rTreg)/FrⅢ比例与CD8+T细胞呈负相关，CD8+T细胞活化诱导IL-6的表达，提示COPD中Treg功能缺失加重免疫系统稳态的破坏[10]。目前研究表明早期肿瘤一旦形成，癌细胞就会通过释放细胞因子和趋化因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等造成周围环境中的免疫细胞比例倾斜，使现有免疫细胞极化成另外一种表现形态。当癌症发生时，肿瘤分泌的TGF-β和IL-15能诱导CD4+T细胞分化形成Treg，逐渐增多的Treg抑制其他免疫细胞功能从而导致机体抗肿瘤免疫能力减弱。目前研究认为在癌变过程中，Treg全身扩散和瘤内积聚是破坏抗肿瘤免疫应答的表现，能诱导免疫抑制作用产生，从而导致肺、乳腺等多种恶性肿瘤的生长和转移。在突变体Kras诱导的A/J小鼠模型中，缺乏FOXP3+Treg的Kras转基因小鼠肺癌发生率下降75%[11]。因此消除Treg细胞效应，解除对杀伤肿瘤细胞的抑制作用成为治疗肿瘤的另一种方法。在慢性肺炎到肺癌的发展过程中，常由于无法确定在临床检查中不同时间点的取样是否与其免疫细胞的改变及临床相关性有关，因而临床罕有关于打破Treg与Th17平衡与肺癌的相关性研究。其主要原因部分可归结于Treg分群较多，对不同分群的功能目前还在探索中[12]。然而，通过基础研究可以确定Th17与Treg平衡的打破能促进肺癌发生发展。

2.2Th17/Treg平衡与肝癌发生 目前病毒性肝炎是导致人类肝脏慢性感染、肝硬化和肝癌的常见因素，其中乙型肝炎病毒(HBV)最为常见，也是肝癌和肝炎密切相关的一种病毒。多项研究表明，在HBV感染发展成原发性肝癌(hepatocarcinoma，HCC)的过程中，细胞免疫应答与病毒之间的相互作用比病毒本身起更重要的作用。在此过程中，Treg逐渐增加，Th17则呈下降趋势，这种不平衡促进了HCC的发展[13]。

2.2.1Th17与肝癌 在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的免疫应答体系中，Th17在预测肝病，尤其是慢性病毒性肝炎进展为肝硬化过程中占据重要地位。针对173名慢性肝病患者的研究发现，CHB患者血清中IL-17蛋白及mRNA水平显著升高(P<0.001)[14]。同时IL-17主要定位于肝组织纤维化区域，与纤维化密切相关[15]。而肝微结构和微循环的变化是HCC发生前的征兆。通常IL-17在肝内与肝星状细胞表面受体结合，刺激诱导转录因子NF-κB和STAT3进入细胞核，上调基质金属蛋白酶2、3、9(matrix metalloproteinase，MMP2,MMP3,MMP9)的表达，并上调基质金属蛋白酶抑制因子Ⅰ(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP1)组织抑制剂的表达和相关蛋白的产生。另外，IL-17还能够激活促炎细胞因子(IL-6、TGF-α)和促纤维化因子(TGF-β1)的基因转录，促进内皮细胞活化，释放吸引型趋化因子CXCL5和CXCL8，促使嗜中性粒细胞和单核细胞进入肝脏。而中性粒细胞本身也可释放IL-17，进而加重肝脏纤维化[16]。Xu等[17]还发现在HCC和胆管上皮细胞的肝细胞中，IL-17能增加肝细胞中TGF-β表达从而诱导肝组织上皮-间质转化，且高表达IL-17A的肝癌侵袭能力更强，转移能力越高，恶性程度也越高。提示在肝炎-肝癌这一过程中积极逆转肝纤维化、减少IL-17的产生是防治肝癌的潜在手段。

2.2.2Treg和肝癌 Treg在乙肝病毒感染的急性和慢性阶段中均起到调节抗病毒T细胞应答和介导宿主免疫损伤的作用。慢性乙型肝炎患者外周循环中Treg数量与血清HBV含量呈正相关，并且在慢性重型乙肝患者肝脏中显示出更多的CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞。而起免疫抑制作用的Treg增多可以控制炎症反应和肝损伤[18]。结合肝脏本身就具有为抵抗胃肠道物质刺激而产生的免疫耐受，多重抑制效果成为肿瘤趁机扩增的 “温室”。说明Treg在肝癌发生发展过程中起重要的调节作用。这一方面表现在Treg数目与疾病严重程度相关，如在晚期HCC患者肝内Treg百分比较早期高；另一方面，在肿瘤区域内Treg的大量积累通过激活细胞表达CD69和人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR ，HLA-DR)来抑制T细胞增殖以及IFN-γ分泌，导致肿瘤内CD8+T细胞浸润减少[19]。下调自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)细胞表面活化性受体D2并分泌抗炎因子IL-10和TGF-β，以此来抑制肿瘤中NK细胞的抗肿瘤功能和树突状细胞(dendritic cells,DC)功能[19]。

目前临床发现Treg和Th17与病人预后差、生存期短、易转移复发有关。这两者的平衡在肝病研究中逐渐受到广泛关注。Th17/Treg的失衡是HBV患者发展为肝硬化、肝癌的危险因素[20]。

2.3Th17/Treg平衡与炎症相关性肠癌发生 炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是胃肠道的一种慢性炎症，可分为克罗恩病(Crohn′s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)2种主要临床疾病。目前国际认为长期存在的慢性炎症是IBD发展成为结肠炎相关结肠癌(colitis-associated colorectal cancer，CAC)的关键诱因[21]。

2.3.1Th17和CAC Th17作为一种定居于小肠固有层的促炎细胞，参与CAC的整个过程。Th17参与IBD发挥作用的主要方式是分泌各种促炎因子(如IL-17、IL-23、IL-21、IL-22)。其中在CAC发生过程中活动期IBD患者的血清和结肠黏膜IL-17表达升高，说明IL-17在其中起关键作用[22]。IL-17具有多种亚型，包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17E、IL-17F，参与多种途径，包括NF-κB、IL-6/STAT3、COX2/PGE2等诱导炎症介质的产生介导肿瘤发生，上调抗肿瘤凋亡基因的表达，刺激肿瘤细胞增殖[21，23]。目前也有报道发现在AOA/DSS诱导CAC小鼠模型中，IL-21缺失可减少肿瘤数量和降低其大小。IL-23作为经典的激活Th17细胞的正向调节因子，能够通过STAT3通路促使Th17分化并协同IL-17参与肿瘤血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达，从而促进肿瘤增殖和转移[22]。这些现象说明Th17细胞分泌的其他细胞因子在CAC的发生发展中同样发挥重要作用。

2.3.2Treg和CAC 有报道称长期处于炎症微环境浸润状态会改变周围免疫细胞表型。Treg在IBD患者肠道固有层中产生一种新亚群：RORγt+Treg，这种细胞能表达Th17相关转录因子RORγt同时也可表达FOXP3[24]。RORγt+Treg通过直接靶向DC的IL-6表达并调控转录因子FOXP3作用于APCs的IL-6的产生，激活IL-6/STAT3信号通路促进肿瘤发生。除此类细胞外，Treg还能上调Th1特异性转录因子T-bet，在炎症部位形成和招募更多的FOXP3+T-bet+Treg细胞。这说明在肿瘤微环境中，Treg中不同转录程序的激活会发挥不同的功能。据此调节Treg的可塑性也许能成为肿瘤治疗的手段。

在IBD患者外周血中Treg减少，Th17增多，Treg/Th17比值降低[25]。然而在CAC小鼠模型和结肠癌患者外周血中Treg急剧增加。这种的转变伴随着新亚群的发现，或许可以加深对Treg和Th17平衡改变的理解，推动CAC进程的研究。

2.4Th17/Treg与其他肿瘤发生 Treg和Th17均不是杀伤肿瘤的“主力”，但却可以通过分泌信号因子和细胞因子影响肿瘤的发生发展。长期炎症浸润伴随理化因素的刺激，Treg和Th17失衡会导致癌前病变，在感染幽门螺杆菌的小鼠体内，DC、巨噬细胞及幽门螺杆菌本身均可诱导Th17分化。同时文献也报道Th17细胞在幽门螺杆菌感染组织中的积累可能是促进癌变的慢性炎症损伤的原因之一[26]。然而在感染幽门螺杆菌儿童的胃中发现Treg增多同时伴有IL-10、TGF-β、IL-6的增加，这些因素反而抑制Th17反应[27]。虽然Th17/Treg的平衡与宿主和细菌之间关系复杂，但目前认为在长期细菌感染的刺激下该平衡是向Treg倾斜的，Th17/Treg比例下降，免疫抑制的进一步增强介导了细菌逃逸，继续加重感染转向癌变[28]。除此之外，在骨癌疼痛(bone cancer pain，BCP)发展过程中，T细胞浸润到脊髓中，Treg与Th17的不平衡促进小胶质细胞的活化，进一步加重BCP，导致癌症情况的恶化[29]。

3 靶向Treg/Th17平衡有望成为肿瘤潜在治疗手段

Th17细胞被Harrington等[30]证实为一个新型促炎细胞系，在功能上与Treg相互抑制，具有独立的转录因子，参与肿瘤、自身免疫性疾病及过敏等疾病。近年来Th17在肿瘤和慢性炎症中的作用逐渐被关注和研究。Treg在大多数肿瘤中介导免疫逃逸，具有免疫抑制作用。Th17/Treg在分化上可以相互转化，其分化类型的转变易受不同代谢影响，目前也有多数研究投向对于这两种细胞的平衡调控，但在自身免疫性疾病中关注和应用较多，而在肿瘤中的治疗目前研究还有待补充。一方面，目前免疫研究主要关注具有直接杀伤肿瘤作用的CD8+T细胞及可以激活此类细胞的免疫细胞例如DC、APC等，旨在提高肿瘤组织中细胞毒性T细胞数目和功能，以此抑制肿瘤的生长和转移；另一方面，使用免疫检查点抑制剂PD-L1和PD-1的抗体，能逆转肿瘤细胞和浸润的Treg对其他免疫细胞的抑制作用，重新启动APC、NK、CD8+T细胞等的肿瘤杀伤作用。但目前临床使用PD-L1和PD-1抑制剂存在不良反应较多，且对于低表达PD-1和PD-L1的肿瘤无显著治疗效果。Treg作为肿瘤微环境中免疫抑制的主力军，其在自身免疫疾病和慢性炎症中都被证实具有可塑性，那么通过改变Treg表型从而重启免疫防御和抑制肿瘤作用是否有效？同时作为慢性炎症浸润的主要群体，在肿瘤进展过程中，真正的Th17数量下降反而出现了exTh17 IL-17AnegFoxp3+细胞。如果将Treg转变为可以引起炎症反应的Th17或者将exTh17 IL-17AnegFoxp3+细胞重新调整为正常Th17是否起到抑制肿瘤作用？ Sharma等[31]发现IDO抑制剂药物能在小鼠体内将Tregs转化为产生IL-17的细胞，增强抗肿瘤反应。同时在自身免疫疾病和器官移植中，可通过调整二者的能量代谢从而降低Th17数目，增加Treg数目[32，33]。联合化疗药物与抑制代谢药物以及免疫疗法是否能更加完善地治疗肿瘤以及改善预后的方法？虽然有研究表明IL-17分泌增多能够促进肿瘤分泌VEGF，且与MVD呈正相关，但除了Th17能分泌IL-17，IL-17+Treg细胞同样也会产生IL-17，但不可能与Th17完全一致[34]。Th17作为一种促炎细胞，能否利用细胞因子募集中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞，从而造成对肿瘤的抑制作用？在炎症转变为癌症过程中，靶向Treg/Th17的平衡是否可以防止慢性炎症恶变为肿瘤？Th17能够分泌的IL-17家族相关细胞因子，不同类型的细胞因子对于炎症和肿瘤的影响各不相同。Treg表现出的不同亚群对疾病的转归也有不同结果，说明在不同疾病状态下，细胞分泌的物质对疾病进程影响可能存在差异。除此之外，微生物和细菌的存在通过此平衡来调控疾病的进展也是新发现。虽然目前对该平衡的研究大多集中于在肿瘤后对于这两种细胞数的探讨以及对病人预后的影响，但通过调整和维持Th17/Treg平衡也许是防止炎症“炎癌转化”的潜在治疗手段。