4株鸭坦布苏病毒的毒力、E基因序列和抗原差异性

2020-01-14杨志远段会娟王小蕾刘立新赵际成潘洁刘月焕林健

中国农业科学 2019年23期

杨志远，段会娟，王小蕾，刘立新，赵际成，潘洁，刘月焕，林健

杨志远，段会娟，王小蕾，刘立新，赵际成，潘洁，刘月焕，林健

（北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097）

【】比较鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus, DTMUV）分离株的毒力、分析E蛋白基因序列、研究抗原差异性，为鸭坦布苏病防控提供依据。【】将DTMUV-HB(2011)、DTMUV-AH(2014)、DTMUV-GX1(2012)、DTMUV-GX2(2015) 4株病毒接种10日龄易感鸭胚进行增殖，并利用6日龄SPF鸡胚测定ELD50。根据测定的病毒含量，将分离毒株稀释为100ELD50/0.5mL，人工感染40只180日龄健康北京鸭，进行临床症状观察、病毒分离、大体剖检，分析分离毒株的毒力有无差异。提取8株DTMUV分离病毒株的RNA，通过RT-PCR扩增E基因，分析比较不同地区的DTMUV的E基因核苷酸和氨基酸序列相似性，构建进化树。利用实验室建立的鸭坦布苏病毒血凝抑制试验分别测定4株病毒阳性血清对4株病毒的HI效价。同时采用固定病毒稀释血清法，利用C6/36细胞测定4株病毒阳性血清对4株DTMUV的血清中和效价。通过交叉血凝抑制试验和血清交叉中和试验比较4株病毒的抗原差异性（R值）。【】(1)各毒株的病毒含量范围在104.7—105.3ELD50/0.1mL。人工感染鸭试验，攻毒后3 d鸭采食量和产蛋量均显著下降，各组病毒分离阳性率均在85%以上，剖检病变主要表现为卵泡变形、出血。(2)分离株序列分析结果表明，核苷酸序列相似性为95.7%—100%，推导氨基酸序列相似性在98.2%以上。遗传进化分析表明共同构成了一个进化分支。(3)4株病毒及其阳性血清进行血凝抑制交叉试验，计算的抗原性差异R值在0.79—1.12之间；进行细胞中和交叉试验，计算的R值在0.79—1.20之间。【】分离的4株DTMUV在毒力、E蛋白基因和抗原性上未见显著差异。

鸭坦布苏病毒；毒力；E基因；抗原性

0 引言

【研究意义】鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus, DTMUV）属于黄病毒科黄病毒属，2010年春季开始在浙江、江苏、山东、河北和北京等地区暴发，以鸭产蛋量下降为主要临床特征[1-3]。疫病暴发初期，研究人员根据临床症状和主要病理变化，曾将该病命名为鸭出血性卵巢炎[4]、类减蛋综合征[5]和鸭病毒性脑炎[6]，2011年首届“水禽疫病防控研讨会”将该病统一命名为“鸭坦布苏病毒病”[7]。北京鸭、樱桃谷鸭、金定鸭、麻鸭、康贝尔鸭和鹅等禽类均可发病[8]，目前已成为养鸭生产中的一种地方流行性疫病，几乎每年都会给养鸭业造成明显的经济损失。开展鸭坦布苏病毒的流行情况调查和遗传变异分析，可为该病的有效防控提供科学依据。【前人研究进展】Tembusu病毒首次于1968年在马来西亚Sarawak地区的蚊子体内分离到[9]，随后分别于1982和1992年在泰国北部日本脑炎流行地区的蚊子体内发现[10-11]。2000年，有研究报道一种与Tembusu病毒核酸的同源性为92%的Sitiawan病毒，感染鸡后能够引起鸡生长发育受阻[12]。引起我国鸭群发病的坦布苏病毒与Bagaza病毒的核酸高度同源[13]。万春和等在鸭坦布苏病毒病灭活疫苗、活疫苗和活载体疫苗研制方面做了大量的研究工作，试验结果均表明疫苗有效[14-21]。在使用疫苗的选择压力下，鸭坦布苏病毒的遗传变异情况如何，目前已有多名研究人员对流行的鸭坦布苏病毒株主要进行了E基因的序列分析[22-26]，因为囊膜蛋白（E蛋白）是黄病毒最大的结构蛋白和主要的包膜蛋白，是宿主抗感染免疫的重要保护性抗原[27]。结果表明，各分离株之间没有显著性差异，但没有直接数据表明抗原性有无差异。【本研究切入点】自2010年鸭坦布苏病毒病暴发以来，虽然曾一度呈现零星散发，但从2012年起该病在我国主要养鸭地区再次大面积流行[28]。该病流行期间，病毒的生物学特性、基因序列和抗原性是否发生变异，尚未见有系统的研究报道。为了回答这些问题，我们利用2010至2016年间分离自山东、河北、广西、安徽、河南等不同地区的DTMUV开展了毒力、E蛋白基因和抗原差异性的比较研究，为DTMUV分子流行病学的研究提供参考信息，为该病的防控和疫苗的研制奠定理论基础。【拟解决的关键问题】鸭坦布苏病毒的毒力是否发生了变化，抗原性是否改变。

1 材料与方法

本试验于2015年2月至2017年8月在北京市农林科学院畜牧兽医研究所完成。

1.1 试验材料

1.1.1 毒株 DTMUV-SD株（2010）、DTMUV-HB株（2011）、DTMUV-GX1株（2012）、DTMUV-BJ株（2013）、DTMUV-AH株（2014）、DTMUV-GX2株（2015）、DTMUV-HN株（2015）、DTMUV-AX株（2016）由北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物疫病研究室分离鉴定、保存。

1.1.2 实验动物 180日龄健康DTMUV抗体阴性北京鸭和10日龄易感鸭胚，购自北京南口北京鸭育种中心，试验鸭及种鸭群未经DTMUV疫苗免疫且无DTMUV疫病流行史；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物有限公司。

1.1.3 细胞 C6/36细胞，123代，购自中国典型培养物保藏中心（武汉大学），北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物疫病研究室增殖扩繁。

1.1.4 试剂 0.5%乳汉液、0.33%鹅红细胞悬液等，均由北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物疫病研究室配制；MEM培养基，购自Hyclone公司；胎牛血清（FBS），购自Life Technology公司；TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、均购自Takara公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒的增殖及鸡胚半数致死量（ELD50）的测定将DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒用无菌0.5%乳汉液1﹕200倍稀释。将稀释的毒种经尿囊腔途径接种10日龄易感鸭胚，每胚0.1 mL，置36—37℃孵育，收获尿囊液。-70℃保存备用。4株病毒尿囊液分别用无菌0.5%乳汉液作10倍系列稀释至10-6，每个稀释度经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1 mL，置36—37℃孵育，观察和记录接种后24—168 h死亡鸡胚，采用Kärber法计算ELD50。

1.2.2 人工感染鸭试验及病毒阳性血清的制备共40只180日龄健康北京鸭，经检测DTMUV抗体呈阴性，随机分成5组，每组8只，1组健康对照，肌肉注射PBS 0.5 mL/只，其余4组各用1株试验用毒株进行人工感染，胸部肌肉接种病毒液0.5 mL/只（含100个ELD50），观察临床症状；攻毒后2 d采血分离血清，按照文献[29]进行病毒分离；攻毒后8 d每组随机取5只进行剖检，观察病理变化。剩余试验鸭在攻毒后14 d，使用相同剂量和相同毒株再次接种加强免疫，接种后15 d采血，分离血清，分别制备成相应毒株的阳性血清，-30℃保存备用。

1.2.3 分离毒株E基因分析利用TaKaRa MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取7株分离病毒株尿囊液病毒RNA，参照GenBank已发布DTMUV的E基因序列设计一对引物，引物序列为DTMUV-EF：5′-ttcagctgtctggggatgc-3′，DTMUV-ER：5′-cggcattgacatttactgcc-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通过TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0进行RT-PCR扩增，目的片段大小为1 506 bp，PCR产物送测序后应用DNAstar ( Version 5. 07) 分析软件比较不同时间不同地区的鸭坦布苏病毒E蛋白的核苷酸和氨基酸序列相似性，并绘制系统发育进化树。

1.2.4 分离毒株交叉血凝抑制试验参照文献[30]，将DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV- GX2 4株病毒接种C6/36细胞后，获得了对0.33%鹅红细胞的血凝特性，利用实验室建立的鸭坦布苏病毒血凝抑制试验操作方法，分别测定了4株病毒阳性血清对4株病毒的HI效价。

1.2.5 分离毒株细胞交叉中和试验将C6/36细胞接种96孔微量细胞培养板，利用C6/36细胞进行DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV- GX2 4株病毒株的TCID50测定，将毒种用MEM培养基作10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度，每个稀释度分别接种5孔，每孔100 μL，置28.5℃作用2 h，然后弃去上清液，加入含2%胎牛血清的MEM培养液100 μL，28.5℃培养120 h。每孔取25 μL上清液测定对0.33%鹅红细胞的血凝性，以75%以上的凝集判为HA阳性。记录接种孔中HA阳性的孔数，采用Reed-Muench法计算。根据4株病毒的病毒含量，采用固定病毒稀释血清法，将4种免疫阳性血清56℃灭活30 min，作2-1—2-6稀释，分别与等量的含200个TCID50的4株病毒液进行交叉混合，37℃作用1 h后，接种于96孔C6/36单层细胞培养板，每孔100 μL，每个稀释度接种5孔，28℃作用2 h，弃去，加入含2%胎牛血清的维持液100 μL。同时设置含100个TCID50、1个TCID50和0.1个TCID50的病毒对照，空白细胞对照，血清对照，继续培养120 h，测定每孔对0.33%鹅红细胞的血凝性，以75%以上的凝集判为HA阳性，按照Reed-Muench公式计算血清中和效价。

如果R=1，表明2株间抗原相同；如果0.67≤R≤1.5，表明2株间抗原性无明显差异；如果0.5≤R＜0.67，表明2毒株间抗原性有小的差异；如果R＜0.5，表明2毒株间抗原性有明显差异；R值越小，抗原性差异越大。

2 结果

2.1 病毒增殖与ELD50的测定

DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒株接种鸭胚后均在48—72 h内死亡，死亡鸭胚发育矮小，收获的尿囊液透明清亮。4株分离毒株测定的病毒含量分别为104.9、104.7、104.9和105.3ELD50/0.1mL。

2.2 DTMUV分离株对北京鸭的毒力

DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒以相同攻毒剂量（含100个ELD50）人工感染试验鸭3 d后，攻毒鸭临床上均出现采食量下降、一过性精神沉郁、体重减轻、拉绿色稀便等症状，健康对照鸭精神状态良好，未见明显异常。攻毒后2 d，4株病毒攻毒鸭的病毒分离阳性率均在85%以上，健康对照鸭未分离到病毒，结果见表1。攻毒后8 d，剖检攻毒鸭均出现明显的卵巢或输卵管萎缩、出血、变形等病变，健康对照鸭未见明显异常。除剖检鸭外，剩余试验鸭均存活。结果表明，4株试验用DTMUV对北京鸭的毒力没有明显差异。

表1 DTMUV人工感染北京鸭试验

“A”表示病毒分离结果阳性鸭数，“B”表示检测鸭数，“/”表示未做

“A” The number of ducks that were positive in virus isolation; “B” The number of ducks in the group; “/” Not done

2.3 DTMUV分离株E基因分析

提取DTMUV-SD、DTMUV-HB、DTMUV-GX1、DTMUV-BJ、DTMUV-AH、DTMUV-GX2、DTMUV- HN、DTMUV-AX等8株病毒核酸，并进行RT-PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳均看到约1 500 bp大小的目的片段，结果如图1。送Takara测序与国内其他DTMUV比较后发现，核苷酸序列相似性为95.7%—100%，推导氨基酸序列相似性在98.2%以上。遗传进化分析表明，7株DTMUV与近几年登录在GenBank的鸭坦布苏病毒在系统进化上共同构成了一个进化分支，图2表明目前在我国鸭群中流行的DTMUV的E基因未出现明显的遗传变异。

M: DL2000 Marker; 1: DTMUV-SD; 2: DTMUV-HB; 3: DTMUV-GX1; 4: DTMUV-BJ; 5: DTMUV-AH; 6: DTMUV-GX2; 7: DTMUV-HN; 8: DTMUV-AX; 9: Negative control

2.4 DTMUV分离毒株交叉血凝抑制试验

分别测定4种病毒株阳性血清对4株DTMUV抗原的交叉HI效价，每种病毒阳性血清有3份，取几何平均值，结果见表2。按照抗原相关系数R值的计算方法计算4毒株间的抗原性差异，详见表3。4毒株间的HI抗原性差异R值在0.79—1.12之间，表明没有明显的抗原性差异。

2.5 DTMUV分离毒株细胞交叉中和试验

2.5.1 TCID50测定结果 DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒的TCID50测定结果分别为10-3.8/0.1mL、10-3.8/0.1mL、10-3.8/0.1mL、10-4.5/0.1mL。

2.5.2 细胞交叉中和试验不同毒株与阳性血清作用1 h后，接种细胞，培养168 h，观察记录细胞病变（通过测定HA效价进行最终判定），计算阳性血清对不同毒株的中和效价，结果见表4和图3。每种病毒阳性血清有3份，取几何平均值，按照抗原相关系数R值的计算方法计算4毒株间的抗原性差异，详见表3。结果表明，R值在0.79—1.20之间，4毒株间的没有明显的抗原差异性，与血凝抑制试验结果一致。

图2 DTMUV分离株E基因进化树

表2 4株DTMUV的HI交叉试验

表3 4株DTMUV的抗原差异性R值

左下方为HI试验抗原性差异比较，右上方为细胞中和试验抗原性差异比较

Comparison of antigenic difference with cross hemagglutination inhibition in lower triangle, comparison of antigenic difference with cross neutralization in upper triangle

3 讨论

鸭坦布苏病毒病2010年在我国江浙一带开始流行，随后迅速扩散到我国主要的鸭养殖地区，目前已发展为地方流行性常在疫病。该病流行期间，DTMUV是否发生了变异？毒力有无增强？抗原性是否发生变化？现有的疫苗是否能对目前的“流行毒株”产生保护？这些是国内各养鸭企业、养鸭场包括疫苗生产企业最为关心的问题。我们利用2010—2016年间不同地区分离到的DTMUV毒株从病毒毒力、E蛋白基因序列和抗原差异性上进行了系统的比较和研究，为初步回答上述问题提供了数据支撑和理论依据。

图3 4株DTMUV阳性血清中和效价

表4 4株DTMUV的细胞交叉中和试验

本研究选用的毒株均为从发病鸭场分离得到，时间跨度从2010—2016年，分布地点有河北、河南、安徽和广西等地。从ELD50和对鸭的人工感染试验来看，病毒含量范围在104.7—105.3ELD50/0.1mL，人工感染鸭的病毒分离阳性率均在85%以上，4株DTMUV对易感动物的毒力没有明显差异，与课题组前期的研究结果一致[29, 32-33]。多名研究人员也进行了动物回归试验，所得的试验结果与本文基本一致。于可响[34]对2010年到2012年分离的6株病毒进行了ELD50的测定，范围在105.0—105.5ELD50/0.2mL。2015年范萍萍[35]利用安徽铜陵分离株进行了动物回归试验，同样也是在攻毒后第3天采食量、产蛋量开始下降，剖检鸭卵巢萎缩、脾脏肿胀、胰脏出血等病变。

目前多篇关于鸭坦布苏病毒株基因序列分析的研究表明，不同地区、不同时间的分离株基因组并无显著性差异，尚未发生较大变异。万春和等[36]发现不同来源（鸡源、鸭源、鹅源、鸽源和蚊源）坦布苏病毒Ｅ基因同源性均较高，未发现该病毒在不同家禽之间有明显宿主特异性。张帅[37]2010—2012年通过对包括其实验室分离的ZJ-407、YY5、ZJ-06在内的35株DTMUV基因序列进行比对分析，发现不同来源的各株病毒之间核酸和氨基酸的同源性分别为97.0%—100%和97.4%— 100%，不同来源的鸭坦布苏病毒之间E蛋白基因未发生明显改变。这与本文对于实验室分离毒株E基因的分析结果一致。

R值判定是用于两种抗原物质相似程度的有效方法，可用于不同物种蛋白抗原相似性的分析。本文通过不同抗原与各自的抗体进行交叉反应，采用R值分析方法，经数学处理扣除试验误差，定量给出试验用毒株抗原的相似程度。从交叉血凝抑制试验、细胞交叉中和试验2个方面对分离的4株DTMUV抗原性作比较分析，其R值范围分别为0.79—1.12和0.79—1.20，抗原比值均大于0.67，根据抗原相关性判定标准可初步判断试验用DTMUV没有明显的抗原性差异。该结论与本研究进行的对试验动物毒力、E基因序列比对及同源性分析结论相符。YU[28]等利用2010—2012年分离的病毒株进行了血清交叉中和试验，结果表明分离毒株为同一血清型。与本文的研究结果一致。

关于鸭坦布苏病毒抗体的检测方法有ELISA[38-39]、乳胶凝集试验[40]、中和试验等，尚未见有HI抗体测定方法的报道。本研究利用实验室建立的HI试验方法对血清中的HI抗体和中和抗体的相关性同时做了比较，从试验结果来看具有良好的相关性，相比ELISA方法和中和试验法，HI抗体检测法具有可靠、简单、用时短和不需要特殊设备等优点，可用于该病的诊断和疫苗效力检验的替代检验方法。

4 结论

目前，DTMUV还没有发现其他血清型，本文试验研究所用的4株DTMUV在毒力、E基因序列和抗原性上没有明显的差异，提示我们目前国内流行的毒株还未产生较大的变异。应坚持进行流行病学调查和疫情监控，监测该病毒的变异趋势。但目前来说，不论是利用发病早期分离的毒株制备的疫苗，还是经过弱化的弱毒苗，或是基因工程疫苗，都可以有效控制鸭坦布苏病毒病的发生和流行，是预防和控制本病最经济有效的办法。

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Virulence, E Gene Sequence and Antigenic Difference of 4 Duck Tembusu Virus Isolations

YANG ZhiYuan, DUAN HuiJuan, WANG XiaoLei, LIU LiXin, ZHAO JiCheng, PAN Jie, LIU YueHuan, LIN Jian

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agricultural and ForestrySciences, Beijing 100097)

【】The research aimed to compare the virulence of Duck Tembusu Virus (DTMUV), and to analysis its envelope protein gene sequence analysis and antigenic difference. 【】Susceptible 10-day-old duck embryos were inoculated with four different DTMUV strains, including DTMUV-HB isolated in 2011, DTMUV-AH isolated in 2014, DTMUV-GX1 isolated in 2012 and DTMUV-GX2 isolated in 2015. The median embryo lethal dose (ELD50) of the four strains was measured with 6-day-old SPF chicken embryos. According to that, forty 180-day-old healthy Peking duck were challenged respectively with four strains which were diluted into 100 ELD50/0.5 ml. The clinical, virological, pathological features of different DTMUV strains infection in ducks were characterized. The viral RNA of eight DTMUV strains were extracted from the allantoic fluid, and then the E gene were amplified by RT-PCR and sequenced. Then the similarity analysis of nucleotide and amino acid sequence and phylogenetic analysis were carried out. The HI titers of 4 antisera against 4 DTMUV strains were determined with duck tembusu virus hemagglutination inhibition test. The neutralization titers of 4 antisera against 4 DTMUV strains were determined by neutralization assay using C6/36 cell lines. We analyzed the antigenic difference of 4 DTMUV strains by R value, which contained cross hemagglutination inhibition test and cell cross neutralization test. 【】(1) The median embryo lethal dose (ELD50) were 10-4.7-10-5.3/0.1ml. The artificial infection test suggested that, feed intake and egg production of the challenged group decreased significantly on 3 days post inoculation (dpi), and the virus positive isolation rate were more than 85% on 2 dpi. The gross lesions of the reproductive system were mainly deformed and hemorrhaged follicular by necropsying on 8 dpi. (2) The results of sequence analysis showed that nucleotide sequence similarity was 95.7% - 100%, and the similarity of amino acid sequence was 98.2%. Genetic evolutionary analysis illustrated that all the DTMUV isolates in this study gathered into the same clade. (3) The R value showed antigenic difference of cross hemagglutination inhibition test were 0.79-1.12, and that of cell cross neutralization test were 0.79-1.20. 【】There were no significant difference in virulence, E gene sequence and antigenicity of four DTMUV strains isolated in this study.

Duck Tembusu virus; virulence; envelope protein gene; antigenicity