苹果LIM基因家族生物信息学及表达分析

2020-01-14袁高鹏韩晓蕾卞书迅张利义田义张彩霞丛佩华

中国农业科学 2019年23期

袁高鹏，韩晓蕾，卞书迅，张利义，田义，张彩霞，丛佩华

苹果基因家族生物信息学及表达分析

袁高鹏，韩晓蕾，卞书迅，张利义，田义，张彩霞，丛佩华

（中国农业科学院果树研究所/农业部园艺作物种质资源利用重点实验室/国家苹果育种中心，辽宁兴城 125100）

【】在苹果全基因组中鉴定，通过分析启动子作用元件、保守结构域、基因聚类、基因结构、染色体定位以及组织表达模式，为研究和利用苹果奠定基础。利用苹果基因组数据库GDR和PLAZA，获得苹果家族成员并进行编号。苹果LIM蛋白氨基酸序列的基本信息通过ExPASy Proteomics Server进行预测，利用Cell-PLoc进行亚细胞定位预测，利用CD-Search Tool进行LIM结构域分析，采用MEGA 7软件构建进化树，采用GSDS绘制基因结构，并利用TBtools软件对鉴定得到的进行染色体定位，通过实时荧光定量RT-PCR对的组织表达进行分析，并利用SPSS 18.0软件分析差异显著性。共鉴定得到11个苹果家族成员，这些MdLIM蛋白包含96—222个不等的氨基酸残基，等电点分布在6.14—9.01。亚细胞定位结果显示，MdLIM蛋白在细胞核中均有分布。启动子作用元件分析表明，11个启动子上分布有响应激素、环境适应性和逆境诱导的元件。蛋白保守结构域分析表明，11个MdLIM蛋白中除MdLIM8具有单LIM结构域外，其余10个均具有双LIM结构域。根据聚类分析结果可将分为4组。染色体定位结果显示，分布在苹果17条染色体中的7条，且在7条染色体上的分布不均匀。花、叶、果皮和茎中的实时荧光定量RT-PCR结果显示，4个组织中均能检测到的表达，且表达量具有一定差异。苹果基因家族包括11个成员，进化上可分为4组，11个基因分布于7条染色体上，在不同组织中的表达具有多样性和特异性。

苹果；全基因组；家族；生物信息学；表达分析

0 引言

【研究意义】LIM蛋白是一类半胱氨酸富集的蛋白（cysteine-rich proteins，CRPs），在动物[1-3]、酵母和植物[4-6]中广泛存在。LIM蛋白广泛参与细胞的发育及分化调节，并且能够调控多种基因的转录，在细胞核或细胞质中均有分布，也可穿梭于两者之间[5]。我国苹果栽培面积和产量均居世界第一，但生产上常面临诸多问题，其中苹果果锈作为一种非侵染性生理病害，在沿海和内陆多湿地区苹果主栽品种都易发生，正严重威胁我国苹果产业发展[7]。苹果果锈的发生与苯丙烷途径中相关基因的表达有关[8]，而LIM蛋白可以调控苯丙烷生物合成通路中相关基因的表达[9-10]。开展苹果家族的生物信息学及表达分析研究，可为苹果LIM蛋白功能的深入研究，以及今后培育无锈苹果新种质奠定理论基础。【前人研究进展】真核生物的LIM蛋白分子结构中往往包含1个或多个锌指结构，并且都含有高度保守的LIM结构域，通常由50余个氨基酸残基构成，其序列为：CX2CX16-23HX2CX2CX2CX16-21CX2-3（C/H/D)[11]。被子植物LIM蛋白可以划分为4个亚组（部分具有小亚组）：αLIM1（FLIM1、WLIM1、PLIM1）、βLIM1、γLIM2（WLIM2）、δLIM2（PLIM2-I、PLIM2-II）[12]。关于植物LIM蛋白的早期研究主要集中于向日葵[13-14]、烟草[15]和拟南芥[16]等模式物种，随后在棉花[17-19]、杨树[20]、百合[21]、橡胶树[22]、玉米[23-24]、水稻[25]、高粱[10]等物种上也分离获得LIM蛋白。植物中的LIM蛋白一般具有两大功能：（1）作为转录因子调控靶基因，如作为转录因子调节苯丙烷生物合成途径相关基因的表达[3,9-10]；（2）作为肌动蛋白的结合蛋白，调节肌动蛋白细胞骨架结构，如细胞骨架形成的调节功能[26-27]。首次得到的LIM蛋白是来自向日葵的HaPLIM1蛋白，该蛋白在花粉中特异表达，并结合肌动蛋白细胞骨架，另外，向日葵原生质中的HaWLIM1蛋白与皮层微管相关联，有助于细胞骨架稳定[13-14]。罗明等[17]将棉花在棉花植株中过表达，结果发现棉花木质素含量增加，表明其作为转录因子对木质素合成途径中相关基因（、和）的表达起正调控作用。李彤[10]将高粱在拟南芥中过表达，发现转基因植株中苯丙烷代谢途径相关基因（和）的表达均受到抑制，并且发现过表达株系中木质素的含量明显降低。【本研究切入点】苹果果锈的发生与苯丙烷代谢途径多个基因的表达有关[8]，但目前对于苹果果锈的关注重点大多在MYB转录因子的调控作用[8,28]，对于LIM蛋白如何调控苹果中苯丙烷相关基因表达的分子机制尚不清楚。【拟解决的关键问题】利用生物信息学的方法，鉴定并分析苹果基因组中全部，从基因组水平上分析苹果LIM家族的启动子作用元件、染色体定位、基因结构和组织表达模式。

1 材料与方法

试验于2017—2019年在中国农业科学院果树研究所/农业部园艺作物种质资源利用重点实验室/苹果育种中心实验室进行。

1.1 材料

苹果材料来源于中国农业科学院果树研究所国家苹果种质资源圃（辽宁兴城）17年生‘金冠’苹果（Golden Delicious），在花后20 d对果实进行套袋和不套袋处理，不套袋果实有重度果锈，套袋果实无果锈；‘短枝旭’苹果（Macspur，无果锈）；‘斯塔克金矮生’苹果（Starkspur Golden Delicious，重度果锈）。果锈程度的划分根据聂继云等[29]制定的标准。套袋‘金冠’苹果取其花、叶、果皮、茎用于不同组织的基因表达分析，其余品种在成熟时取其果皮用于不同程度带锈品种的基因表达分析，材料经液氮速冻后快速转移至-80℃冰箱保存备用。

1.2 MdLIM家族成员鉴定及LIM结构域分析

苹果家族序列信息来自GDR数据库（https:// iris.angers.inra.fr/gddh13/）和PLAZA数据库（https:// bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v3_dicots/）[30-31]。拟南芥和陆地棉的LIM氨基酸序列分别来自TAIR（http://www.arabiodpsis.org）和Cotton Reaearch Institute（http://mascotton.njau.edu.cn）。烟草、油菜、甜橙、蓝桉、野草莓、大豆、雷蒙德氏棉、苜蓿、小立碗藓、高粱、马铃薯、葡萄和玉米的LIM氨基酸序列来自Phytozome数据库（https://phytozome. jgi.doe.gov/pz/portal.html）[32]。

利用在线软件SMS2（http://www.detaibio.com/ sms2/trans_map.html）将下载得到的苹果家族成员转换成氨基酸序列并对其编号。采用ExPASy Proteomics Server（http://web.expasy.org/protparam/）分析苹果LIM蛋白氨基酸序列的分子量、长度和等电点[33]。利用在线软件Cell-PLoc（http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）进行亚细胞定位分析[34]。利用在线软件MEME（http://meme-suite.org/tools/ meme）对LIM蛋白的motif进行分析，利用在线工具Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）对苹果LIM结构域进行分析。

1.3 MdLIM启动子元件分析

从苹果GDR数据库（https://iris.angers.inra.fr/gddh13/）截取苹果翻译起始位点（ATG）上游2 000 bp的启动子序列，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析启动子反应调控元件，并利用TBtools[35]软件对特定表达元件的数量开展聚类分析。

1.4 系统进化树构建

利用MEGA7.0软件比对分析苹果中11个LIM蛋白以及拟南芥（AtWLIM1，At1g10200，gi|837558；AtWLIM2a，At2g39900，gi|818577；AtWLIM2b，At3g55770，gi|818577；AtPLIM2，gi|819188，NC_003071.7；AtPLIM2b，At1g01780，gi|839267；AtPLIM2c，At3g61230，gi|825295）、烟草（NtWLIM1，AAD56948，gi|AAD56948；NtPLIM1a，AAF13231，gi|107810326；NtPLIM1b，AAF13232，gi|107802998；NtLIM1a，DV999848.1；NtLIM1b，DW004416.1；NtWLIM2，CAA71891，gi|CAA71891；NtPLIM2，AAF75828，gi|107796302；NtLIM1，BAA82827，gi|107824896）、陆地棉（GhWLIM2a，AAL38006，gi|107962044）、油菜（BnPLIM2a，CX191460.1）、甜橙（CsWLIM1，CK933805.1；CsLIM1，CV720040.1）、蓝桉（EgWLIM1，BAD91878.1）、野草莓（FvWLIM2，DY672997.1）、大豆（GmWLIM1a，BU084575.1；GmWLIM1b，BU089834.1；GmLIM1，CX709969.1；GmWLIM2，CX703844.1）、雷蒙德氏棉（GrPLIM2a，CO128503.1；GrPLIM2b，CO122392.1；GrPLIM2c，CO128788.1）、苜蓿（MtWLIM1，AJ498553.1；MtWLIM2，BG585852.1）、小立碗藓（PpLIM，BJ946868.1）、高粱（SbWLIM2，CN127879.1）、马铃薯（StWLIM1，BQ115637.1；StLIM1b，DN908198.1；StWLIM2，CV504017.1）、葡萄（VvLIM1，CF213597.1；VvWLIM2，CB974935.1）和玉米（ZmWLIM1，DR826954.1；ZmWLIM2，AY103686.2；ZmPLIM2a，EB167114.1；ZmPLIM2b，DV169657.1）的LIM蛋白氨基酸序列，进化树使用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建，Bootstrap设置为1 000次[36]。

1.5 MdLIM结构分析及染色体定位

利用在线软件GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析家族结构，利用TBtools软件进行染色体定位分析[35]。

1.6 MdLIM定量表达分析

用于荧光定量PCR分析的苹果材料如1.1所述。RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司，cDNA第一条链合成所采用的反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。各的荧光定量引物如表1所示，选用作为内参基因。反应体系为：SYBR Green 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.75 μL，ddH2O 9 μL，cDNA 2 μL，总体积25 μL。反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。样品均为3次重复。试验所得数据采用2-ΔΔCT计算[37]，利用SPSS18.0进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 苹果LIM家族成员及LIM结构域

对苹果全基因组进行分析，共鉴定得到11个成员（表2）。利用在线工具Smart（http://smart. embl-heidelberg.de/）对获得的11个LIM家族成员作进一步确认（图1），结果显示其全部含有LIM结构域（CX2CX16-23HX2CX2CX2CX16-21CX2-3(C/H/D)）。MdLIM蛋白特性分析表明，最长的MdLIM10含222个氨基酸残基，而最短的MdLIM8仅含有96个氨基酸残基；MdLIM蛋白的等电点分布在6.14（MdLIM1）和9.01（MdLIM7）之间（表2）。根据Cell-PLoc预测显示，全部11个MdLIM蛋白均为细胞核蛋白，其中MdLIM2和MdLIM11在高尔基体中也有分布。

通过Conserved Domains和TBtools软件对苹果LIM蛋白保守结构域进行比对发现，除MdLIM8只含有1个LIM结构域外，其余10个MdLIM蛋白均含有两个LIM结构域（图2）

2.2 苹果LIM家族成员启动子作用元件分析

通过PlantCARE对翻译起始位点上游2 000 bp的启动子顺式作用元件进行分析，然后对激素诱导表达元件、环境适应及逆境诱导表达元件在启动子上的数量进行聚类分析（图3）。对激素诱导表达的相关元件分析发现，脱落酸、生长素、赤霉素、茉莉酸甲酯和水杨酸等5种激素诱导表达元件在11个启动子上均有2—5种分布；在环境适应和逆境诱导表达元件中，光诱导元件分布最多，其次为厌氧、防御和胁迫、低温、干旱、生理节律等诱导元件。

表1 荧光定量PCR引物序列

表2 苹果中LIM家族信息

图1 LIM蛋白motifs

图2 MdLIM蛋白保守结构域

2.3 苹果LIM家族成员系统进化及基因结构分析

Arnaud等[20]根据编码LIM蛋白的基因序列构建的系统树表现出的亲缘关系，将植物LIM蛋白重新分为4类：LIM1（FLIM1、WLIM1、PLIM1）、LIM1、LIM2（WLIM2）和LIM2（PLIM2-I、PLIM2-II）。将苹果中LIM蛋白的氨基酸序列与其他植物LIM蛋白的氨基酸序列构建进化树（图4）。结果显示，苹果中的LIM蛋白可分为4类，其中，MdLIM3、MdLIM8和MdLIM11属于LIM1蛋白，MdLIM5和MdLIM10属于LIM1蛋白，MdLIM2和MdLIM7属于LIM2蛋白，MdLIM1、MdLIM4、MdLIM6、MdLIM9属于LIM2蛋白。

对家族成员的基因结构进行分析（图5），结果表明，只含有1个外显子，含有4个外显子，含有5个外显子，含有6个外显子。

图3 基于苹果基因组GDDH13数据库的MdLIM家族基因启动子元件聚类分析

图4 苹果LIM家族进化树

图5 苹果LIM基因家族结构

2.4 苹果LIM的染色体定位

为了解苹果在染色体上的分布情况，对11个进行了染色体定位（图6）。11个在苹果7条染色体上呈不均匀分布，其中1号、6号、7号和14号染色体均含有2个成员；5号、8号和15号染色体各自只含有1个成员；其余10条染色体未有基因定位。

2.5 苹果LIM的组织表达

通过实时荧光定量RT-PCR分析11个在苹果不同组织中的表达特性。结果表明，在苹果的花、叶、果皮（果皮来自套袋果实花后150 d的果皮）和茎中均有表达，但其表达量具有一定差异（图7）。和在花中具有较高的表达量，与在其他组织中的表达量相比有显著差异（＜0.05），并且和在其他组织中几乎不表达。和在茎中的表达量和其他组织相比有显著差异（＜0.05）。

图6 苹果LIM在染色体上的位置

不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05). The same as below

2.6 苹果LIM在不同品种果皮中的表达

通过实时荧光定量PCR分析和（在进化树分析中与聚为一类，而已被证明直接调控木质素合成途径相关基因的表达）在不同程度果锈品种中的表达量（图8）。结果表明，和在无锈果实（Macspur和GD T）上的表达量均高于带锈果实（Starspur GD和GD CK），且差异达到显著水平（＜0.05）。

Macspur为‘短枝旭’苹果，GD T为‘金冠’套袋果实，GD CK为‘金冠’不套袋果实，Starspur GD为‘斯塔克金矮生’苹果

3 讨论

不同植物的家族基因成员数目差异不大，杨树[20,24]中有12个LIM蛋白，水稻[20]中有6个，拟南芥中有9个[23]，本研究通过对苹果全基因组进行分析，共获得11个家族基因，比拟南芥中的多2个，可能是因为苹果具有17条染色体，在苹果基因组中得到了扩展。本研究所获得的11个苹果LIM蛋白中，10个含双LIM结构域，1个含单LIM结构域。单LIM结构域蛋白只保留了N端的LIM结构域，虽然C端产生了高度保守的结构域，并且依然富含半肌氨酸残基，但是其并没有形成典型的LIM结构域，这可能是LIM结构域发生了异化。在苹果LIM蛋白的结构域中，无论是单LIM结构域还是双LIM结构域，其Motif均含有52个氨基酸残基，具有完整的植物LIM蛋白保守结构域，具有完整的LIM蛋白功能[23]。

本研究发现，苹果启动子上的一些顺式作用元件数量相差不多（如光诱导和厌氧诱导元件），前人对玉米的LIM蛋白研究结果也表明，单、双LIM结构域的基因启动子上供分析的顺式元件相差不大[23]，这在一定程度上表明单、双结构域LIM在基因水平上的亲缘关系较为密切。

系统进化树结果表明，聚类关系越近，具有类似功能的可能性越大[38]。在本研究所构建的进化树中，LIM蛋白可分为4类，每类中的MdLIM蛋白极有可能与该类中其他物种已知的LIM蛋白具有类似功能。如MdLIM8和MdLIM11与NtLIM1聚为一类，表明MdLIM8和MdLIM11可能与NtLIM1具有相似功能。研究表明，烟草的NtLIM1蛋白可以在体内激活含有PAL-box启动子所驱动的表达，将在烟草中反义表达，导致苯丙烷代谢途径相关基因（、、等）的表达量下降，并且木质素的含量降低20%以上[9]。果锈的发生与苯丙烷途径代谢产物木栓质和木质素密切相关[8,28-39]，进一步对和的分析结果表明，不带锈果实和的表达量显著高于带锈果实。以上结果表明，苹果LIM蛋白可能参与苯丙烷途径相关基因的调控。

对苹果结构分析发现，的外显子数量具有差异（1—6个），可能是基因的结构在复制后产生了变化。ARNAUD等[20]对植物结构的研究表明，大部分植物含有4个内含子，本研究中大部分的含有4—5个外显子，这一结果和前人研究结果类似[12,20]，表明该类基因在进化上具有保守性。本研究获得的11个在苹果7条染色体上呈不均衡分布，可能是由于苹果在进化过程中发生了复制或重组，这些基因大多属于具有较高同源性的同一基因家族[23]。苹果在复制的过程中也导致其结构发生了变化，这对基因的功能具有较强影响，表明片段重复和串联重复在MdLIM蛋白的多样性上具有重要的作用[40]。

基因的组织表达情况与其功能之间存在密切联系[41]。11个在‘金冠’苹果的花、叶、果皮和茎中均有表达，但是在不同组织中的表达量存在一定差异，表明苹果可能参与了不同器官的发育，其中和在茎中的表达量较高，表明其可能在木质素代谢过程中起重要作用。随着生物信息学和基因工程技术的快速发展，苹果在苯丙烷代谢途径中的作用将可能成为今后研究的重要方向。

4 结论

鉴定得到11个苹果，分为4类，定位到苹果7条染色体上。组织特异性表达分析表明，不同在不同组织中的表达模式具有多样性和特异性，并且发现和可能与果锈的形成有关。

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Bioinformatics and Expression Analysis of theGene Family in Apple

YUAN GaoPeng, HAN XiaoLei, BIAN ShuXun, ZHANG LiYi, TIAN Yi, ZHANG CaiXia, CONG PeiHua

(Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Fruit Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture/National Apple Breeding Center, Xingcheng 125100, Liaoning)

【】In order to lay a basis for the further functional research and application ofgenes, this study were carried out to analyze the bioinformatics (e.g promoter action element, conserved domain, gene clustering, gene structure, chromosome localization) and expression of the LIM gene family in apple. 【】Based on the apple genome database GDR and PLAZA, the members ofgene were identified. The MdLIM amino acid sequence prediction, subcellular localization prediction, LIM domain analysis, and phylogenetic tree the gene structure were completed by ExPASy Proteomics Server, Cell-PLoc, CD-Search Tool, MEGA7, and GSDS, respectively. In addition, the expression pattern ofgenes in different tissues and in peels with different degree of fruit russeting in samples was analyzed by real-time qRT-PCR.【】A total of elevengenes were identified from apple genome. These MdLIM proteins contained 96-222 amino acid residues with isoelectric points ranging from 6.14 to 9.01. The results of subcellular localization showed that the apple LIM proteins were distributed in the nucleus. Analysis of promoter showed these 11genes contained cis-acting elements related to hormone responses, environmental adaptability and adversity induction. Conserved domains showed that ten MdLIM proteins had double LIM domains except MdLIM8. According to the phylogeny relationship,genes were divided into four categories. The expression patterns of the 11genes in flowers, leaves, fruit peels and stems were determined by real-time RT-PCR, and the results showed that their diverse and specific expression could be detected in all of the four tissues, suggesting that they might play different roles in different tissues. 【】Elevengenes were identified from the whole genome of apple, and they could be divided into four groups, and distributed on 7 chromosomes with diverse and specific tissues expression patterns.

apple; genome-wide;family; bioinformatics; expression analysis