苹果NLP（Nin-Like Protein）转录因子基因家族全基因组鉴定及表达模式分析

2020-01-14王寻陈西霞李宏亮张富军赵先炎韩月彭王小非郝玉金

中国农业科学 2019年23期

王寻，陈西霞，李宏亮，张富军，赵先炎，韩月彭，王小非，郝玉金

王寻，陈西霞，李宏亮，张富军，赵先炎，韩月彭，王小非，郝玉金

（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

【】探究苹果NLP转录因子全基因组特征与表达模式，以便更深入地了解其结构特点与作用机制。基于本地BLAST数据库和Pfam数据库两大数据库，运用blastp和hmmsearch两种查询策略，对苹果全基因组范围内的NLP转录因子家族成员进行鉴定。经过严格筛选与确认后，对搜索结果进一步展开分析，主要分为3部分，包括NLP蛋白分析、分析与苹果表达分析，其中ProtParam、Clustal Omega、MEGA7、MEME 5.0.2、SOPMA、Phyre2、WoLF PSORT、STRING等程序或软件用于蛋白质分析，基因分析使用MG2C、GSDS 2.0、PlantCARE、psRNATarget等在线工具，对于苹果表达情况利用qRT-PCR进行定量检测。从苹果全部蛋白数据库中共筛选出6个NLP成员，系统进化分析可将它们分为I、II、III三类；蛋白二级结构以无规则卷曲为主，其次是-螺旋，占比最小的是-转角；亚细胞定位预测均定位于细胞核中，符合转录因子的特征；染色体定位显示5个基因（MDP0000584547除外）定位于4条染色体上；启动子分析发现大量与激素和逆境响应相关的顺式作用元件，暗示它们可能参与到激素和逆境信号的调控过程中，此外还识别到一个响应氮的GCN4作用元件，进一步说明该类转录因子与氮素有密不可分的关系；通过定量检测揭示苹果NLP家族在茎、叶等组织高表达的特征模式，并且表达分析结果也证实苹果响应氮饥饿、干旱胁迫等。通过对苹果全基因组的分析，共识别6个NLP转录因子，对6个基因的结构与蛋白保守域分析，发现它们之间具有极高的相似性、保守性，同时又存在差异。类比拟南芥NLP蛋白的关联网络，推测与拟南芥NLP7同源性最高的MDP0000132856可能也具有复杂的功能。

苹果；NLP转录因子；氮信号；生物信息学

0 引言

【研究意义】植物氮素作为一种养分，对于植物生长发育具有十分重要的意义，近些年，氮素吸收转运相关基因的功能调控研究比较广泛，其中RWP-PK家族中的NLP转录因子亚家族响应氮饥饿并且在植物氮信号调节过程中处于中心地位[1]。因此，通过的研究可以对氮素调节网络相关基因进一步认识，从而对植物氮素利用提供指导。尤其是在苹果等果树上，通过研究该基因，为提高果树氮肥利用效率与提质增效带来新的思考。【前人研究进展】关于NLP（Nin-like protein）最早的研究可以追溯到豆科模式植物百脉根（nodule inception），起初作为根瘤感受基因，被鉴定影响到根瘤的早期发育[2]。随后，在非豆科植物中对同源基因进行了大量鉴定，其中包括拟南芥[3]、水稻[3]、小麦[4]、玉米[5]、毛果杨[6]、枳[7]、甘蓝型油菜[8]等。随着对研究的深入，包括该家族蛋白结构域、调控网络、表达模式等在一定程度上被揭示。前人通过比较不同物种NLP基因家族，发现NLP转录因子具有两个典型的特征结构域，高度保守的RWP-RK结构域以及一个位于羧基端的PB1结构域，除此之外，在氨基酸序列的氨基端还有一个类似于GAF的结构域；已知RWP-RK结构域可以与DNA结合发挥作用，PB1结构域被认为具有蛋白质与蛋白质相互作用的功能[3]。关于的功能，模式植物拟南芥已有大量相关研究，MARCHIVE等[9]探究发现拟南芥中NLP7在早期响应硝酸盐中扮演了重要角色，YAN等[10]证明NLP8对于硝酸盐促进种子萌发至关重要，LIU等[11]发现在植株营养生长中重要的NO3--CPK-NLP信号通路，YU等[12]报道过表达拟南芥通过增强氮和碳的同化，在限制氮和充足氮的条件下均可以促进植物生长。上述研究证实，NLP转录因子在硝态氮响应与植株生长发育中发挥重要节点作用。【本研究切入点】许多豆科植物和非豆科植物中NLP转录因子家族基因已经进行了鉴定，苹果中相关信息尚未见报道，本研究利用已发布的苹果参考基因组[13]（×-genome.v1.0）对全基因组范围内的NLP转录因子成员进行搜索。【拟解决的关键问题】本研究采用生物信息学手段，首次对苹果NLP转录因子全基因组成员进行鉴定，并从基因和蛋白水平上系统地对其预测分析，此外运用荧光定量PCR技术检测的组织表达、氮响应过程及非生物胁迫变化情况，从而有助于苹果NLP转录因子特点与功能的进一步探究。

1 材料与方法

试验于2018年9月至2019年4月在山东农业大学作物生物学国家重点实验室进行。

1.1 植物材料与处理

试验材料为种植于山东农业大学园艺试验站（山东泰安）的十年生‘皇家嘎拉’苹果树和培养于实验室中的生长4个月左右的苹果砧木‘平邑甜茶’实生苗。在‘皇家嘎拉’苹果树上分别取根、幼嫩茎、叶、花（初花期）、果实（花后70 d）后，将各组织迅速于液氮中冷冻，然后放置到-80℃超低温冰箱贮藏，后续用于基因组织表达分析。从‘平邑甜茶’实生苗中选取生长状况等较为一致的幼苗分别用于3个试验处理：氮饥饿处理、干旱胁迫处理、ABA处理，其中对各个处理的每个取样时间节点设置3个生物学重复。氮饥饿处理：取培养于基质中的实生苗18株，转移至氮饥饿环境（蛭石+浇施缺氮营养液（成分：1.2 mol∙L-1KH2PO4、0.1 mol∙L-1CaCl2、1 mol∙L-1MgSO4、0.1 mmol∙L-1Fe盐、微量、1 mol∙L-1KCl））继续培养，0、3、6、12、24和36 h分别全株取样。干旱胁迫处理：取培养于基质中的实生苗24株，转移至干旱环境（干燥基质）继续培养，0、0.5、1、3、6、12、24和48 h分别全株取样。ABA处理：取培养于基质中的实生苗18株，转移至ABA处理环境（浇施0.1 mmol∙L-1ABA溶液）继续培养，0、1、3、6、12和24 h分别全株取样。3个试验处理所取样品迅速置于液氮中冷冻，而后储存于超低温冰箱，后续用于氮饥饿响应分析和非生物胁迫表达分析。

1.2 苹果NLP转录因子家族成员的识别

从NCBI下载拟南芥9个NLPs成员蛋白序列，苹果蛋白数据库来自GDR[14]（https://www.rosaceae.org），采用-genome.v1.0版本，以9个拟南芥序列为查询序列，以苹果全部蛋白序列为库，进行本地blastp搜索，其中E值设定为小于1e-5；此外，基于隐马尔科夫模型的查询策略，从Pfam数据库[15]（http://pfam.xfam.org/）下载蛋白保守结构域RWP-RK(PF02042)文件，执行hmmsearch命令，其中E值设定为小于1e-5。采用两种方法得到的苹果NLP蛋白去重与整合后，通过NCBI的Batch CD-search与EMBL的SMART进行结构域（RWP-RK、PB1）确认，最终获得苹果NLP转录因子家族成员。

1.3 苹果NLP蛋白分析

1.3.1 苹果NLP蛋白理化特征分子量大小、等电点等信息利用EXPASY中的在线工具ProtParam（http:// web.expasy.org/protparam/）进行计算。

1.3.2 苹果NLP多序列比对与结构域分析蛋白质多序列比对采用在线软件Clustal Omega（https:// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），比对结果在桌面版Jalview（Jalview 2.10.5）程序中进行编辑与可视化。

1.3.3 苹果NLP的系统进化分析水稻6个NLP成员下载于Phytozome数据库（https://phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html），来自拟南芥、水稻、苹果NLP全部蛋白质序列用于构建系统发生树，构树软件使用MEGA7[16]，多序列比对采用内置Muscle程序，参数保持默认，构树方法选择Neighbor-joining，检验方法选择bootstrap method，重复1 000次，置换模型选择poisson model。

1.3.4 苹果NLP保守基序分析 Linux系统中使用MEME[17]（版本：MEME 5.0.2）工具进行保守模体分析，参数设置为“meme MdNLPs.fa-protein-oc motif.out- nostatus-mod zoops-nmotifs 15-minw 6-maxw 60”。

1.3.5 苹果NLP蛋白质结构分析蛋白质二级结构预测利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），对其中保守结构域的三级结构进行预测，使用Phyre2在线网站[18]（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi? id=index）。

1.3.6 苹果NLP亚细胞定位预测亚细胞定位预测使用在线程序WoLF PSORT：Protein Subcellular Localization Prediction[19]（https://www.genscript.com/ wolf-psort.html），生物类型选择植物。

1.3.7 苹果NLP家族蛋白相互作用网络预测通过功能蛋白关联网络在线网站STRING[20]（https://string- db.org）预测NLP家族成员相关蛋白的互作关系，物种来源选择模式物种拟南芥。

1.4 苹果NLP分析

1.4.1 苹果染色体定位在苹果基因组注释文件（×.v1.0.consensus.gff）中根据基因ID提取苹果NLP家族成员位置信息，提交至在线软件MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）用于基因染色体定位。

1.4.2 苹果结构分析利用基因注释信息，在北京大学基因结构可视化服务器GSDS2.0[21]（http://gsds. cbi.pku.edu.cn/）中进行苹果NLP转录因子基因特征分析。

1.4.3 苹果基因GO功能注释从注释文件中获取苹果的GO条目信息，对功能注释进行分类统计。

1.4.4 苹果的启动子分析从苹果基因组中提取翻译起始位点ATG上游约2 000 bp的片段作为启动子区域，将所有的启动子序列提交至PlantCARE[22]（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/），进行启动子顺式作用元件的预测分析。

1.4.5 与苹果相关miRNA的预测利用植物小分子RNA靶标分析在线网站psRNATarget[23]（http:// plantgrn.noble.org/psRNATarget/）对与苹果相关的miRNA进行预测。

1.5 苹果NLP表达模式分析

‘皇家嘎拉’苹果树的根、茎、叶、花、果不同组织，‘平邑甜茶’苹果苗的氮饥饿处理、干旱胁迫处理、ABA处理各时间点样品，对它们的总RNA分别使用TRIzol Reagent试剂盒提取，RNA完整性和浓度分别利用琼脂糖凝胶电泳、Thermo Nano Drop 2000仪器检测。反转录合成cDNA过程采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒，实时荧光定量PCR按照UltraSYBR Mixture（High ROX）试剂提供的方法进行，反应体系如下：2×UltraSYBR Mixture（High ROX）10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物（10 mmol∙L-1）各1 μL，cDNA模板为1 μL，总体系为20 μL。qRT-PCR反应过程为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，58℃退火15 s，65℃延伸10 s，进行40次循环，其中每次循环第3步采集荧光信号，每个反应进行3次重复。定量引物的设计利用在线网站Primer3Plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/ dev/primer3plus.cgi），所有引物特异性均经过NCBI的Nucleotide BLAST和Primer-BLAST（https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）验证。本次试验所使用的引物列于表1，其中（CN938023）作为苹果内参基因。基因相对表达量的数据分析采用2-ΔΔCT的方法[24]，用Excel作图。

2 结果

2.1 苹果NLP转录因子家族成员鉴定及基本信息

通过两种方法并进行严格筛选、确认，最终共获得6个，且基因组注释文件（×. v1.0.consensus.gff）均注释到存在RWP-RK结构域、PB1结构域（MDP0000788505的蛋白氨基酸C末端缺失，只注释到RWP-RK结构域）。根据其在染色体上的位置信息，依次命名为（MDP0000788505）、（MDP0000265619）、（MDP0000246881）、（MDP0000239938）、（MDP0000132856）、（MDP0000584547）。经统计发现，6个长度最小的为（3 856 bp），最长的为（10 212 bp），编码序列长度在2 460—5 121 bp，编码氨基酸数目在819—1 706，蛋白质的分子量在90 889.49—189 398.44 D，等电点5.45—7.9，具体信息见表2。

2.2 MdNLP蛋白结构域分析与多序列比对

在鉴定MdNLP的过程中，通过NCBI的SMART蛋白结构域查询，可以发现苹果NLP蛋白与拟南芥NLP蛋白均含有两个典型的结构域（RWP-RK和PB1），使用Clustal Omega在线工具对9条拟南芥与6条苹果NLP蛋白序列进行多序列比对，并用Jalview对两个结构域进行编辑截取。由图1可知，RWP-PK结构域保守性非常高，由大约50多个氨基酸组成，其中包含“RWPXRK”特征核苷酸组成，该结构域中只有极少的氨基酸位点一致性较差。在NLP蛋白C端的PB1结构域保守性较高，由大约80个氨基酸组成，比较特殊的是MdNLP1的PB1结构域C端部分缺失，只有大约30个氨基酸。

表2 苹果NLP家族基因、蛋白特征及亚细胞定位预测

图1 拟南芥与苹果NLP蛋白的多序列比对与典型保守结构域

2.3 苹果NLP蛋白系统发生树及Motif分析

来自苹果、拟南芥、水稻的全部NLP蛋白序列（MdNLP1—6、AtNLP1—9、OsNLP1—6）用于构建系统发生树，以RWP-RK结构域部分缺失的OsNLP6作为外类群。由图2-a进化树分支结构可以看出NLP家族蛋白明显被分为3类，与SCHAUSER等[3]的研究结果一致，在苹果NLP家族中，MdNLP6为一类（I），MdNLP2、MdNLP3、MdNLP4为一类（II），MdNLP1、MdNLP5聚为一类（III），拟南芥中研究最多的NLP7位于分支的第III类。苹果与拟南芥NLP蛋白经MEME软件分析（图2-b），识别的15种保守基序在这些序列中基本均有分布。其中RWP-RK保守结构域由Motif1和Motif12组成，PB1结构域由Motif5、Motif9、Motif15构成。对于MdNLP1而言，由于其C端PB1结构域不完整，只检测到Motif9，而Motif15和Motif5两个基序缺失。除此之外，参照CHARDIN等[25]的研究，对NLP蛋白另外的一个N端GAF结构域进行标注，苹果NLP蛋白中GAF结构域包括Motif3、Motif4、Motif6、Motif8、Motif11、Motif13，与拟南芥的保守基序组成一致。

a图中红色实心圆点代表苹果NLP蛋白，绿色实心三角代表拟南芥NLP蛋白，蓝色实心方形代表水稻NLP蛋白

2.4 苹果NLP蛋白结构预测

对MdNLP蛋白进行二级结构预测，从表3看出，6个蛋白质二级结构都以无规卷曲和螺旋为主，其中无规卷曲占到最大比例，此外二级结构中还包含转角，所占比例都是最小的，而且在这些蛋白质中各二级结构所占比例大致相似。为了比较苹果NLP蛋白中3种结构域（GAF-like、RWP-RK、PB1）的结构特征，本次研究采用同源建模的方法绘制出保守区段的三维蛋白模型（图3）。通过比较这些模型，很直观地观察到苹果NLP蛋白保守域结构的高度相似性，而往往特定结构与特殊功能相关联，对此猜测苹果中NLP家族的功能离不开这些区域。此外，注意到MdNLP1蛋白的PB1区段发生缺失，由于缺失序列较长，无法模拟出三级结构，这导致了其功能相较于其他家族成员可能会出现差异。

表3 苹果NLP蛋白质二级结构

2.5 苹果NLP蛋白的亚细胞定位预测

拟南芥中NLP7被证明，在没有硝酸盐信号时其存在于细胞质中，外部施加硝酸盐后，NLP7聚集到细胞核中[9]，这是很明显的转录因子的特点。为了验证苹果中此类蛋白的定位情况，利用亚细胞定位预测在线网站WoLF PSORT对其进行鉴定，结果（表2）证实苹果NLP有极大可能性定位于细胞核，很低的比例预测到非细胞核区域，符合转录因子的特征。

2.6 苹果NLP蛋白相互作用蛋白网络构建

为了预测苹果中NLP转录因子潜在的功能，利用STRING网站根据模式物种拟南芥中的同源序列，构建了苹果NLP蛋白相互作用关系网络（图4），由图可知，MdNLP1对应AT1G64530（AtNLP6），MdNLP2对应AT3G59580（AtNLP9），MdNLP3与MdNLP4均对应AT2G43500（AtNLP8），MdNLP5对应NLP7（AT4G24020），MdNLP6对应AT1G76350（AtNLP5）；网络图显示，与拟南芥NLP蛋白相互作用的有硝酸盐转运蛋白NRT1.1（AT1G12110）、NRT2.1（AT1G08090），胞质硝酸还原酶NIA1（AT1G77760）等，可以看出，NLP蛋白大多和氮素转运、同化等蛋白相关。此外，由拟南芥的相互作用蛋白，注意到AtNLP7和AtNLP6关系比较复杂，相关联蛋白较多，预测苹果中MDP0000132856和MDP0000788505相较于其他的苹果NLP家族成员可能具有更关键的作用。

2.7 苹果NLP染色体定位、基因结构分析与GO功能注释

利用苹果基因组注释（×.v1.0. consensus.gff）对苹果进行染色体定位及基因结构分析，通过比较发现苹果分别定位于2号染色体（）、4号染色体（）、12号染色体（和）、15号染色体（），由于非染色体定位，没有在图中展示（图5-a）。由苹果外显子-内含子分析可以得知外显子数目在5—14，另外，有意思的是和，和分别具有非常相似的基因组成（图5-b），加上前文对苹果NLP蛋白结构和系统进化关系的分析，推测这两组组内可能具有极其类似的功能。利用苹果基因组注释文件中GO（Gene Ontology）条目，对苹果的GO分类功能注释进行了统计（表4），GFF文件共提取到3个的9个GO编号，分别是（GO:0005524，GO:0017111，GO:0016887，GO:0016020，GO:0016021，GO:0006810，GO:0000166），（GO:0008270，GO:0000166，GO:0003676），（GO:0000166，GO:0003676，GO:0008270），GO分类共分为分子功能、生物途径、细胞组分3大部分，MdNLP家族富集到的GO条目主要集中于分子功能中的核苷酸结合、锌离子结合、核酸结合等。此外，生物途径一类中注释到1个有关转运的功能，以上都间接证明苹果NLP家族是作为转录因子发挥作用的。

图3 苹果NLP蛋白保守域三级结构的同源建模预测

苹果同源蛋白编号以红色字体突出显示 The name of apple homologous proteins are highlighted in red

图5 苹果NLP基因的染色体定位（a）与基因结构分析（b）

表4 苹果NLP GO分类统计列表

2.8 苹果NLP的启动子分析及其相关miRNA预测

通过对启动子的分析（表5），鉴定到了大量和激素相关的顺式作用元件，其中包括响应生长素的TGA-element，响应赤霉素的GARE-motif，响应乙烯的ERE，响应脱落酸的ABRE，响应茉莉酸甲酯的CGTCA-motif，响应水杨酸的TCA-element等元件。另外，还在启动子中预测到了一个与氮素响应相关的GCN4元件[26]，这与KUMAR等[4]在小麦中的研究结果相似。MicroRNA作为一种小分子调节物质，广泛参与到基因的表达调控过程中，本研究对苹果NLP基因家族成员相关联的miRNA进行预测。依据前人关于氮素响应相关miRNA的研究[27-28]，在预测中发现了一些可能参与NLP介导的氮响应的miRNA，主要是mdm-miRNA169、mdm-miRNA171、mdm-miRNA395三个家族，结果列于表6，推测这些miRNA可能通过与MdNLP转录因子相互作用进而调控氮响应过程。

表5 苹果NLP启动子的顺式作用元件预测

表格第一行表示顺式调控元件与响应类型，表中数字代表正链与负链上的顺式元件个数

The first row of the table shows the cis-regulating elements and response types, and the numbers in the table represent the number of cis-regulating elements on the positive and negative chains

2.9 苹果NLP转录因子家族基因表达模式

为了研究苹果NLP家族基因的时空表达规律，对苹果的组织表达模式进行了定量分析。根据图6结果可知，苹果NLP基因家族成员不同发育时期的表达特征稍有差别，但大致相似。所验证的4个（由于结构域缺失、非染色体定位，此处没有检测，后文定量研究均采用上述考虑）在根、茎、叶、花、果中均有不同程度的表达，明显可见苹果中NLP家族基因更偏向在叶片、茎等营养器官中表达，、、、基因表达量最高的部位分别是茎、叶片、叶片、叶片。

为了研究氮素匮乏条件下的响应过程，对‘平邑甜茶’实生苗进行氮饥饿处理，结果发现（图7），在所取的氮饥饿处理的几个时间节点，所检测的4个基因，相较于最初的0 h，基因表达量均有不同程度的提高，表达变化趋势大致相似，先升高后降低。

表6 推测与苹果NLP相关的响应氮素的miRNA

图6 苹果NLP组织表达分析

图7 苹果NLP氮饥饿响应表达分析

由于NLP转录因子可能与植物的抗旱性有关[7]，对此，本研究进行了苹果干旱胁迫表达分析。由图8可以发现，除了，其余3个基因（、、）在研究的时间范围内，随着干旱胁迫时间的增加，基因的表达量均呈现出先升高，到6 h表达量达最高，之后降低的一种表达情况。

除此之外，在对苹果启动子进行分析时，找到大量与激素相关的调控元件，本研究还分析了ABA处理下苹果的表达模式，结果如图8所示。、在ABA诱导下表达量总体上调，而、表达量则呈现总体下调的趋势。

3 讨论

一直以来，转录因子家族的研究都是一个热点话题，这是因为功能基因调控机制的阐释离不开转录因子。例如对成员数目较多的一些转录因子家族的分析：MYB[29]、NAC[30]、bHLH[31]、bZIP[32]、WRKY[33]、LBD[34]。本研究对一个响应氮饥饿的Nin-like转录因子家族在苹果全基因组中进行了鉴定，并且利用生物信息学的手段，系统分析了此类转录因子的基因与蛋白特征以及不同处理下的表达水平。

NLP转录因子的功能已经进行了大量研究，除了已知的响应硝酸盐信号，还具有调节干旱胁迫抗性[35]的特点，另外有研究发现Nin通过与NLP相互作用介导硝酸盐对结瘤的抑制作用[36]，GUAN等[37]证明NLP6/7与TCP20的相互作用可以促进N饥饿条件下根分生组织的生长。

本研究基于已公开发表的苹果基因组测序数据[13]，一共识别到了6个苹果基因家族成员，已知拟南芥中有9个[3]，水稻中有6个[3]，GE等[5]鉴定了9个玉米，曹雄军等[7]在甜橙蛋白质组数据中筛选到4个甜橙，由此可见在不同物种中数量存在差异。通过将拟南芥和苹果NLP蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，发现在保守结构域RWP-RK附近除个别氨基酸位点外，其余位置保守程度很高，这一结构域对DNA结合很重要，另外位于C末端的PB1结构域相对较为保守，比较特殊的是，MdNLP1（MDP0000788505）C端缺失，关于N端附近的GAF-like结构域，朱新宇等[38]通过比较NLP与Nin的GAF区段二、三级结构，发现该区域存在变异，导致它们可能执行不同功能。

图8 苹果NLP非生物胁迫（干旱处理和ABA处理）表达分析

拟南芥中已知，NLP6和NLP7通过感知硝酸盐信号后活性被诱导，进而结合到具有硝酸盐响应元件（nitrate-responsive elements，NREs）的一系列和硝酸盐转运、同化相关的基因上，包括高亲和力硝酸盐转运基因、亚硝酸还原酶等基因的启动子上，硝酸还原酶的3′侧翼区等[39]。KONISHI等[40]报道两类转录因子基因和也可能是NLPs的靶基因，它们可能在响应硝酸盐过程中触发二级转录事件。本次将苹果NLP蛋白映射到模式植物拟南芥中，同样地发现了这些与NLP相互联系的基因，其中涉及硝酸盐转运、同化以及受氮诱导调控、影响氮素代谢的部分基因。类比拟南芥NLP6和NLP7，苹果中MDP0000788505、MDP0000132856在关联网络中处于关键节点位置，推测也具有非常重要的功能。以作靶基因，对其潜在microRNA进行预测，找到了大量的可能与其相互作用的miRNA，参考其他物种中的miRNA的作用规律，有意思的是在本研究发现了3个可能靶向于并且响应硝酸盐的miRNA家族，分别是mdm-miR169、mdm-miR171和mdm-miR395，其中2个miR171成员和9个miR395靶向作用于，2个miRNA169、5个miRNA171和9个miRNA395成员靶向作用于，苹果中这些可能的调控作用有待进一步验证。

关于的组织表达模式，CHARDIN等[25]通过分析GENEVESTIGATOR数据库中有关拟南芥和水稻不同组织中的表达水平，发现分布广泛，几乎分布于所有的已检测组织中（包括拟南芥的幼苗、根、茎、花，水稻的叶、节、花序等），其中在拟南芥中，和在衰老的叶片和种子中偏向表达，在水稻中，和偏向在源组织中表达；吴翔宇等[6]对毛果杨表达芯片数据进行提取，结果显示毛果杨偏向在嫩叶、根中表达，除此之外，部分家族成员还在木质部这一输导组织中有表达。与以上研究结果类似，本研究检测的4个几乎分布于苹果的根、茎、叶、花、果各组织中，不同部位表达存在较明显的差异，但更偏向于在茎、叶等器官中表达，这一特征可能与其参与转运硝酸盐的功能紧密联系。同时，苹果相较于表达量较高的茎组织而言，在根中的表达要低得多，说明苹果NLP发挥作用涉及到硝酸盐的转运阶段，而不是硝酸盐的吸收过程，与KUMAR等[4]在小麦NLP中的研究观点相吻合。

在氮饥饿处理条件下，苹果表达呈现先升高后降低的趋势（0—36 h），而LIU等[8]对甘蓝型油菜中进行氮饥饿响应分析，发现在0—72 h阶段内随着时间延长，甘蓝型油菜幼苗叶片和根的表达主要存在两种趋势：逐渐上升和逐渐下降。由此可见，苹果与甘蓝型油菜的氮饥饿响应过程存在差异，可能是由于采样部位不同造成（本研究整株取样，甘蓝型油菜一文中为叶片和根分别取样），亦或是不同物种相同基因的表达存在差异。

对苹果苗干旱胁迫处理，发现3个苹果（、、）随着干旱胁迫时间的延长，基因相对表达量逐渐增加，增大到最大值（6 h）后逐渐减少，这与曹雄军等[7]研究干旱条件下，在枳叶片中的表达变化模式相似。氮饥饿处理和非生物胁迫处理结果表明，苹果NLP转录因子响应氮饥饿过程、参与干旱胁迫进程等，由此可见，在氮代谢与逆境响应环节均发挥了重要的作用。考虑到MDP0000132856与拟南芥NLP7的高同源性，互作网络暗示其可能具有类似的调控关系，下一步可以围绕该基因重点展开研究。

4 结论

从苹果全部蛋白质序列鉴定MdNLP转录因子家族成员6个，启动子和miRNA预测分析表明它们响应氮素，并可能被其他基因或小分子RNA所调控。组织表达模式分析观察到苹果偏向表达于茎、叶等地上部的营养器官，这也说明NLP蛋白在硝酸盐转运过程中的重要功能；氮饥饿响应表达分析，也再次证实苹果NLP转录因子参与到氮素的调节过程。综合比较发现苹果NLP不同的成员蛋白结构和表达模式大致相似，但存在部分差异，推测在响应硝酸盐的过程中扮演着不同但又有关联的角色。

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Genome-wide Identification and Expression Pattern Analysis of NLP (Nin-like Protein) Transcription Factor Gene Family in Apple

WANG Xun, CHEN XiXia, LI HongLiang, ZHANG FuJun, ZHAO XianYan, HAN YuePeng, WANG XiaoFei, HAO YuJin

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong)

【】The study was carried out to explore the whole genome characteristics and expression patterns of NLP transcription factors in apple, and further understand its structural characteristics and mechanism.【】Based on the local BLAST database and Pfam database, the members of NLP transcription factor family in the whole genome of apple were identified by using two query strategies with blastp and hmmsearch. Through strict filtration and confirmation, the results were used for further analysis, and analysis mainly divides into three parts, including NLP proteins analysis, analysis ofgenes andexpression analysis in apple. Programs or softwares, such as ProtParam, Clustal Omega, MEGA7, MEME 5.0.2, SOPMA, Phyre2, WoLF PSORT and STRING, were used for protein analysis, online tools included MG2C, GSDS2.0, PlantCARE, psRNATarget, were used for gene analysis, and the expression ofgene was quantitatively detected by qRT-PCR.【】6 NLP members were identified from apple protein databases, which were classified into three categories by phylogenetic analysis: I, II and III. The protein secondary structure was dominated by random coil, followed by alpha-helix, and the smallest proportion was beta-turn. The prediction of subcellular localization was located in the nucleus, which was consistent with the characteristics of transcription factors. Chromosome localization showed that five genes (except MDP0000584547) were located on four chromosomes. Promoter analysis revealed a large number of cis-acting elements related to hormone and stress response, suggesting thatgenes might be involved in the regulation of hormone and stress signals. In addition, a nitrogen-responsive GCN4 element was also identified, further indicating that such transcription factors were closely related to nitrogen. By quantitative detection, the pattern which NLP family had high expression in stem and leaf of apple was revealed. And the expression analysis results also confirmed thatgenes responded to nitrogen starvation and drought stress, and so on.【】Through the apple genome analysis, 6 NLP transcription factors were found; the analysis of structure and conserved domain of protein for 6 gene suggested that there had a very high similarity and conservation between them, at the same time, they were different in a way; the associated protein network of NLP family inwere used for MdNLPs, MDP0000132856, which had the highest homology with AtNLP7, might also have complicated features and functions.

apple; NLP transcription factor; nitrogen signal; bioinformatics