梅归参颗粒挥发油GC-MS分析及体外抑菌活性研究

周莹，黄意勉 ，余泳仪，陈秋霞，关凤坤，廖锦彬，张建军

[1.广州中医药大学基础医学院，广东 广州 510006； 2.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006； 3.广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)，广东 广州 510095]

梅归参颗粒是广东省第二中医院的医院制剂(粤药制字Z20150010)，由辛夷、当归、肉桂、干姜、白芷、花椒等多味中药组成，具有温阳益气、补益脾肺、通窍泻浊、活络的功效，用于过敏性鼻炎鼻痒、喷嚏、流清涕、鼻塞时作者，临床疗效显著。过敏性鼻炎，又称变应性鼻炎，是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的递质释放，多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的、以鼻黏膜变应性炎症为特征的Ⅰ型变态反应性疾病[1]。过敏性鼻炎虽然不会危及患者的生命，但却极大地影响着患者的生活质量。据Bousquet等报道，至2001年，全球已有近四分之一的患者受此疾病的困扰[2]。过敏性鼻炎的致病因素目前尚不十分明确，比较认可的有，微生物、花粉、动物皮毛以及遗传因素等[3-5]。另外，研究发现，鼻腔微生物在过敏性鼻炎的发病过程中占有十分重要的地位[6]。梅归参颗粒挥发油是梅归参颗粒的重要组成部分，由辛夷、当归、肉桂、干姜、白芷、花椒6味药通过水蒸气蒸馏法提取而得。本文对梅归参颗粒中挥发油部位开展化学成分分析，及抗菌抑菌实验，以期为阐明梅归参颗粒的物质基础提供依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

BSC-1300-II-A/B3生物安全柜(苏州工业园区鸿基洁净科技有限公司)；GSP-9160MBE隔水式恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；FD50A高压灭菌器(广州合众生物科技有限公司)；AUY120电子天平(SHIMADZU)；SpectraMax190全波长扫描多功能酶标仪(上海美谷子仪器有限公司)；安捷伦7890B-5977A 气相色谱-质谱仪[安捷伦科技(中国)有限公司]。

1.2 药材及菌种

标准菌种金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、大肠埃希菌(CMCC44102)、铜绿假单胞菌(CMCC10211)、伤寒杆菌(CMCC50071)、变形杆菌(CMCC49027)、乙型溶血性链球菌(CMCC32210)均购自广东省食品药品检验所。

1.3 试剂及药品

MHA培养基、MH培养基购自青岛海博生物技术有限公司；硫酸庆大霉素注射液(批号180602)购自广州白云山天心制药股份有限公司；10 μg庆大霉素含药纸片购自广州有田生物科技有限公司。

2 方法

2.1 梅归参颗粒挥发油样品的制备

按处方称取当归、肉桂、干姜、辛夷、白芷、花椒6味药材饮片投入提取罐中，加饮片量8倍量水，浸制1 h，通入蒸气加热，收集挥发油5 h，分液漏斗收集挥发油。用移液枪吸取质量浓度为954 mg/mL的梅归参挥发油100 μL，加入MH培养基3 068 μL，加入32 μL吐温80助溶，制成质量浓度为29.8 mg/mL的药液，即得。

2.2 培养基的制备

2.2.1 水解酪蛋白琼脂培养基(mueller-hiinton agar，MHA)的制备 称取本品42 g，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，待冷至50 ℃，倾入无菌平皿，备用。

2.2.2 水解酪蛋白肉汤培养基(mueller-hinton broth，MH)的制备 称取本品21 g，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

2.2.3 生理盐水的制备 称取NaCl 9 g，溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

2.3 菌悬液的制备

将供试菌接种至新鲜斜面培养基上培养，各挑取菌种到生理盐水中，制成0.5号麦氏比浊管的菌液，其浓度为1.5×108cfu/mL。

2.4 庆大霉素溶液的制备

用移液管吸取40 μL浓度为40 mg/mL的庆大霉素到2 mL MH培养基中，制成浓度为0.8 mg/mL的庆大霉素溶液。

2.5 抑菌作用的测定

2.5.1 纸片扩散法[7]用打孔器将滤纸打成直径为60 mm的圆纸片，于121 ℃灭菌30 min，备用。分别取制备好的浓度为0.5号麦氏比浊管的不同供试菌悬液0.1 mL，涂布到直径为90 mm平板表面，再将纸片贴在平板上，分别吸取5 μL梅归参挥发油原油到纸片上，以庆大霉素药敏片(含药10 μg)为阳性对照组，以溶液空白药敏片为阴性对照，置于37 ℃培养箱倒置培养24 h，重复3次。以mm为单位，测量抑菌圈直径，取平均值。运用SPSS软件进行统计分析。

2.5.2 肉汤稀释法测挥发油最小抑菌浓度(MIC)[8]采用微量肉汤二倍稀释法。取10 μL备用的浓度为0.5号麦氏比浊管菌悬液至10 mL MH培养基中，吹打均匀，此时细菌密度约为1.0×106cfu/mL，用于MIC的测定。于96孔板中2～7号孔里加入MH培养基100 μL。1号孔加入200 μL质量浓度为29.8 mg/mL的梅归参稀释溶液，用移液枪吸取100 μL药液于2号孔内，混匀。依次进行二倍稀释至7号孔，吸取7号孔中100 μL药液，弃之。1～7孔分别加入浓度为1.0×106cfu/mL的菌液100 μL，使孔内的药物终浓度分别为14.90、7.45、3.73、1.86、0.93、0.47、0.24 mg/mL。10号孔内加入MH培养基200 μL作为阴性对照，11号孔内加入100 μL MH培养基和100 μL菌液作阳性对照，12号孔加入质量浓度为20 μL/mL庆大霉素溶液和100 μL菌液作阳性药对照。另外在孔板上按上述方法依次稀释药液，最后加入MH培养基100 μL作为药液空白对照组。每个质量浓度平行9组，置于37 ℃培养箱中培养24 h，用肉眼观察结果。观察各孔底部是否有细菌沉淀，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为梅归参颗粒挥发油的MIC。

2.5.3 最低杀菌浓度(MBC)测定[9]根据MIC测定结果，将未见细菌生长孔的培养液100 μL接种到MHA平板上，涂布棒涂匀，于37 ℃培养箱中倒置培养24 h，培养基上没有细菌生长的药物最低浓度为最低杀菌浓度(MBC)。

2.6 分析条件

2.6.1 色谱条件 色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30 m×250 μm,0.25 μm)，柱温采用程序升温，初温50 ℃，保持2 min后以2.5 ℃/min升至200 ℃，保持6 min，再以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，进样口温度250 ℃，进样量1 μL，载气为氦气。分流比为5∶1。

2.6.2 质谱条件 EI源电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃。倍增电压为1.28 kV，扫描范围为30-800原子质量单位，扫描速率为3.8次/s，溶剂延迟3.8 min。

2.7 样品处理

取0.25 mL梅归参颗粒挥发油用环己烷定容到5 mL，0.22 μm微孔滤膜滤过，待GC-MS检测。

3 结果与分析

3.1 梅归参颗粒挥发油的滤纸片扩散法试验结果

梅归参颗粒挥发油对6种供试菌均有良好的抑菌作用(P<0.01)，抑菌效果见表1。由以滤纸片法测定的抑菌圈直径为指标，评定梅归参颗粒挥发油对6种供试菌的抑菌效果[8]：无抑菌圈者为不敏感、抑菌圈直径<12 mm为低度敏感、抑菌圈直径12～20 mm为中度敏感、抑菌圈直径>20 mm为高度敏感。梅归参颗粒挥发油对大肠埃希菌和乙型溶血性链球菌为高度敏感，对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌和变形杆菌为中度敏感，对铜绿假单胞菌低度敏感。由此可见，梅归参颗粒挥发油具有显著的抑菌作用。

表1 梅归参颗粒挥发油纸片扩散法药敏试验结果

菌种挥发油组阳性对照组阴性对照组金黄色葡萄球菌17.00±1.4∗∗##27.00±0.82∗∗6.00±0.00大肠埃希菌23.67±1.70∗∗22.00±0.00∗∗6.00±0.00铜绿假单胞菌9.00±0.82∗∗##26.33±0.47∗∗6.00±0.00变形杆菌18.67±1.89∗∗##25.6 7± 0.47∗∗6.00±0.00乙型溶血性链球菌60.00±2.16∗∗##30.67±1.70∗∗6.00±0.00伤寒杆菌19.33±1.15∗∗20.67±0.58∗∗6.00±0.00

与阴性对照组比较：**P<0.01； 与阳性对照组比较：##P<0.01

3.2 MIC测定结果

根据抑菌圈试验结果，用96孔板连续稀释法进行各种供试菌的MIC实验，结果表明梅归参颗粒挥发油对6种供试菌均有抑菌效果，见表2。

表2 梅归参颗粒挥发油对各种供试菌种的最小抑菌浓度

Table2MIC value of essential oils from Meiguishen granules (n=3)

菌种MIC/(mg·mL-1)金黄色葡萄球菌1.86大肠埃希菌3.73铜绿假单胞菌14.91变形杆菌3.73乙型溶血性链球菌1.86伤寒杆菌7.45

3.3 最小杀菌浓度(MBC)测定结果

各供试菌的MBC测定结果见表3。

3.4 GC-MS测定结果

按照上述GC-MS条件，对梅归参颗粒挥发油采用自动进样，解析3 min，进行色谱分离，得到总离子流图，见图1。所得图谱经峰面积归一化法计算各组分的相对质量分数，对总离子流色谱图进行分析和处理、NIST08.L谱库检索和查对有关资料[10-15]，鉴定各个化合物结构与名称，最后确定、且相对质量分数大于0.01%的化学成分列于表4。

表3 梅归参颗粒挥发油对各种供试菌种的最小杀菌浓度

Table3MBC value of essential oils from Meiguishen granules (n=3)

菌种MBC/(mg·mL-1)金黄色葡萄球菌7.45大肠埃希菌14.90铜绿假单胞菌7.45变形杆菌3.73乙型溶血性链球菌3.73伤寒杆菌14.90

98765432101020304050607080?107丰度t/min

图1梅归参颗粒挥发油总离子色谱图

Figure1Total ion flow diagram of essential oils from Meiguishen granules

表4 梅归参颗粒中挥发油化学成分信息表Table 4 Main chemical composition of essential oils from Meiguishen granules

表4 (续)

4 讨论

梅归参颗粒是用于治疗过敏性鼻炎的医院制剂，临床疗效显著。梅归参颗粒挥发油是由梅归参颗粒中的辛夷、当归、肉桂、干姜、白芷、花椒6味药通过水蒸气蒸馏提取而得，是梅归参颗粒的重要组成部分。实验运用GC-MS技术对梅归参颗粒挥发油进行成分分析鉴定，共得到138个可识别峰，鉴定出相对质量分数≥0.1%的化学成分有25种，其中相对质量分数>1.0%的化学成分有8种，占总挥发油的66.48%。分析结果为阐明梅归参颗粒的物质基础提供了一定依据，所建立的方法学为梅归参颗粒的质量标准提高提供了参考。

过敏性鼻炎，是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的递质释放，多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的、以鼻黏膜变应性炎症为特征的Ⅰ型变态反应性疾病[1]。其致病因素与细菌有着密切的关系。研究报道，从慢性感染-过敏性鼻炎患者的鼻黏膜中常可分离出葡萄球菌、链球菌等细菌，患者鼻咽黏膜的细菌繁殖常超过健康人，从而使细菌性变应性病变迁延，并促使其转为慢性[16]。陈蕙芳等[17]报道，有一植物组方可以杀死引起鼻炎的有害菌，并在鼻腔中形成一层保护膜防止继发性细菌感染，防止鼻炎复发。基于细菌对过敏性鼻炎的影响，为了更好地阐明梅归参颗粒用于治疗过敏性鼻炎的药理作用和药效物质基础，研究开展了梅归参颗粒挥发油对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、乙型溶血性链球菌、伤寒杆菌6种致病菌的体外抑制活性研究。结果表明：梅归参颗粒挥发油对6种试验菌均有显著的抑制作用；滤纸片扩散法实验结果显示对乙型溶血性链球菌的抑制作用尤为显著，优于阳性对照10 μg的庆大霉素纸片。本研究为阐明梅归参颗粒的物质基础奠定了一定的基础，但体内抗菌效果及抗菌的作用机制还有待进一步研究。