外源褪黑素对‘爱媛38号’柑橘品质和乙醇代谢的影响

王晶，洪敏，冯雨,2，贺明阳,3，王日葵,2*，喻最新，周炼

1(中国农业科学院 柑桔研究所，重庆，400712) 2(西南大学 柑桔研究所，重庆，400712)3(中国科学院 华南植物园，植物资源保护与可持续利用重点实验室，广东 广州, 510650)

柑橘是我国重要的经济作物之一，因其味道酸甜可口、风味浓郁且营养充分，深受消费者喜爱。然而柑橘经采摘后，随着时间的延长果实失去水分，风味逐渐变淡，通常还积累异味物质。乙醇是柑橘在贮藏期间积累的主要异味物质之一[1]，果实产生褐斑、浮皮枯水和水肿等生理病害与其有密切联系[2]，因此乙醇的积累是决定果实风味和品质好坏的重要因素之一。经研究表明，柑橘果实中乙醇的积累情况受果皮厚度[3]、贮藏温度[4]与涂膜处理[5]等因素的影响，同时这些因素也会使其他风味物质和果实基本品质发生变化。近些年来，学者们通过不同调控方式改善果实的风味与品质，这些研究已经在猕猴桃[6]、番茄[7]和梨[8]等果实上实现。

褪黑素(melatonin，MT)是一种吲哚胺类物质，是多数动植物体内合成的天然抗氧化剂，对人体有促进睡眠、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等功效[9]，在植物中其能调节植物的生长衰老，增强植物对胁迫的耐受性，提高果实的抗逆性[10]。目前褪黑素在果实生长调节[11]、贮藏品质[12]与抗性研究[13]方面已有一定进展，但是褪黑素对柑橘采后品质和风味的研究还比较少。

‘爱媛38号’是南香与西子香杂交选育出的新兴品种，成熟期较早，由于其果面光滑美观，口感细腻化渣、清香爽口、风味极佳，市场需求前景广阔[14]。本文通过研究褪黑素对柑橘果实品质与乙醇代谢的影响，为柑橘果实贮藏品质与风味调控提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用‘爱媛38号’柑橘果实，于2018年10月30日采自四川资阳，采收时选择成熟度一致(八成熟)、大小一致并且无机械损伤的果实，采后将果实随机分成CK、MT 2组，MT组果实经质量浓度为1.0 g/L的褪黑素溶液浸泡10 min，CK组用清水浸泡作为对照组。晾干后单果薄膜套袋，置于6～8 ℃环境中贮藏。入库贮藏后分别于贮藏0、10、20、40、60 d时进行相关指标的测定分析。

2,4-二硝基苯肼，上海沪试；三氯乙酸(TCA)，天津市光复精细化工研究所；二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、无水乙醇(色谱级)、乙醛(色谱级)，Aladdin；交联聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone, PVPP)、2-吗啉乙磺酸、丙酮酸钠，Adamas；丙酮酸脱羧酶(PDC)ELISA试剂盒、乙醇脱氢酶(ADH)ELISA试剂盒，南京草本源生物科技有限公司；植物多糖多酚总RNA提取试剂盒、SYBR®PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂，日本TaKaRa公司；草酸、NaCl、BaCl2、NaOH、酚酞、2,6-二氯靛酚钠等,成都市科龙化工试剂公司。

1.2 仪器与设备

Pocket Brix-Acidity Meter Master kit手持式折光仪，日本爱拓公司；CFX98TM Real-Time荧光定量仪,Bio-Rad ；TU-1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；H1850R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Agilent 5977 MSD气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；Varioskan LUX酶标仪，美国赛默飞公司。

1.3 指标测定与方法

1.3.1 感官评定

感官评价采用描述测试法，参考OBENLAND等[15]的方法，稍作改动。选择12名20～25岁的评定人员进行感官评价，12名评定人员分别为6男6女，评价项目与标准如表1所示。评定人员于相同评鉴环境不同品评间，对贮藏60 d后的果实进行评价。评价指标有新鲜度、水分含量、果面缺陷、气味和口感，记录各项目的评分值，收集评分表，进行统计分析。

表1 感官评价项目及评分标准Table 1 Sensory evaluation items and scoring standards

1.3.2 可溶性固形物与可滴定酸含量测定

取10个果实榨汁后，用手持式折光仪测定可溶性固形物和可滴定酸含量，重复测定3次。

1.3.3 抗坏血酸含量测定

采用2,6-二氯靛酚滴定法[16]，单位g/100 mL。取10个果实榨汁后，吸取5 mL原果汁用质量分数1%草酸定容至100 mL，取2 mL置于烧瓶中，用2,6-二氯靛酚滴定，使稀释果汁变成淡粉色，30 s不褪色为滴定终点，重复测定3次。

1.3.4 呼吸强度测定

采用静置碱液吸收法[17]。玻璃干燥器清洗干净，晾干后下面放入培养皿，用移液管吸取10 mL摩尔浓度0.4 mol/L NaOH标准液放入培养皿中，放置隔板，装入10个果子，盖好干燥器，于6～8 ℃下静置2 h，随后将碱液转移到三角瓶中(冲洗3次)，加饱和BaCl2溶液5 mL和2滴酚酞指示剂，用摩尔浓度0.2 mol/L草酸标准溶液滴定，粉色沉淀变成白色为滴定终点，记录草酸用量，重复测定3次。

1.3.5 Real-time qRCR测定

果肉总RNA提取：参照植物多糖多酚总RNA提取试剂盒操作，然后检测其完整性和纯度。使用两步法进行cDNA合成。采用SYBR染料法测定乙醇代谢相关基因在不同贮藏期的转录水平，参照SYBR®PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂盒操作，PCR扩增在实时荧光定量PCR仪上进行。每个样品设3次重复，以ddH2O为阴性对照，采用2-ΔΔct法进行相对定量分析。引物：ACTIN-F：CATCCCTCTCAGCACCTTCC，ACTIN-R：CCAACCTTAAGCACTTCTCC；ADH-F：GCTGGAGGGATTGTAGAAAGTGTAG，ADH-R：CCTGAGGAGGTCACACATATTGCTT；PDC-F：GC AAACGCAATGGGCTCAACGGGTC，PDC-R：CGGCTCCGCT ATGAGATGATCCAAG。

1.3.6 PDC、ADH酶活性检测

将果肉冻样用液氮研磨成粉末，称取8.00 g果肉后加入5 mL 0.1 mol/L MES-Tris提取缓冲液(含2 mmol/L DTT，4% PVPP，pH 6.5)，冰浴研磨成匀浆，于10 000 r/min，4 ℃条件下离心30 min，收集上清液冰浴保存备用。PDC与ADH酶活性测定参照试剂盒操作，重复测定3次。

1.3.7 丙酮酸、乙醇、乙醛含量测定

丙酮酸含量采用2,4-二硝基苯肼法测定[18]，略微改动：将果肉冻样用液氮研磨成粉末，称取8.00 g果肉后加入18 mL体积分数5%TCA，在冰上孵育20 min，随后于4 ℃，10 000 r/min离心15 min，上清液即为提取液。取酶提取物(400 μL)于试管中，加入2 mL DNPH(0.25 g 2,4-二硝基苯肼溶于1 mol/L HCl中)。将试管在37 ℃的水浴中温育10 min。然后加入2 mL 1.5 mol/L NaOH，通过涡旋混合，1 min后立即测定混合液在515 nm处的吸光度。

乙醇、乙醛含量参考OLIVEIRA[19]的方法测定，略有改动，取待测果肉用液氮研磨成粉末，精准称取3.00 g，加入2 mL饱和NaCl溶液，在40 ℃、200 r/min下温育10 min后，顶空萃取20 min(fibre：CAR/PDMS)，上机分析。色谱柱：DB-WAX；进样温度240 ℃，氦气(He)流速1 mL/min，柱温30 ℃，保持7 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。质谱条件：EI，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质谱29～500 amu。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2016软件进行统计处理，采用SPSS 25.0软件的Duncan法进行显著性分析，采用Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对‘爱媛38号’感官品质的影响

‘爱媛38号’果实在采摘后普遍果面明亮饱满、柑橘气味纯正、且酸甜可口、汁胞饱满、口感良好，经过60 d贮藏后，果实均明显出现果面微皱、果香减少、风味寡淡、口感下降、并伴随着枯水的现象。由表2可知，在贮藏结束时，MT组果实的新鲜度显著高于CK组(P<0.05)，果实气味、水分含量、风味和口感与CK组无显著差异，其中MT组果实风味好于CK组。可见褪黑素处理‘爱媛38号’果实后，能够提高其风味并显著提高新鲜度，这可能是因为采后褪黑素处理延缓了果实的衰老[10]。

表2 贮藏结束时感官评价结果Table 2 Sensory evaluation results at the end of storage

注：不同字母表示在P<0.05的水平上存在显著性差异。

2.2 外源褪黑素对‘爱媛38号’基本品质的影响

2.2.1 外源褪黑素对‘爱媛38号’可溶性固形物和可滴定酸的影响

可溶性固形物(total soluble solids，TSS)与可滴定酸(titratable acids，TA)是衡量果实风味和品质的重要指标之一[20]。如图1-A所示，在贮藏期间，果实TSS含量基本呈上升趋势，后期略有下调。CK组果实在贮藏前40 d时由初始8.9%上升至9.4%，在贮藏结束时降至9.05%。MT组果实在贮藏20 d时TSS含量最高，在贮藏20～60 d期间缓慢下降，贮藏60 d时，MT组果实的TSS含量为9.5%，在贮藏期间，MT组的TSS含量始终高于CK组，差异不显著(P>0.05)。

根据图1-B可知，果实的TA含量整体呈下降趋势。2组果实在贮藏10 d时的TA含量均有少许下降，随后在20 d时达到峰值后又逐渐降低。贮藏结束时，CK、MT组的TA含量分别为0.62%和0.56%，在整个贮藏期间，2组果实的TA含量变化趋势大致相同，且MT组的TA含量始终显著低于CK组。LIU等[21]用褪黑素营养液培育番茄后会提高番茄果实的TSS、TA含量，但在本次试验中外源褪黑素虽然可以提高‘爱媛38号’果实的TSS含量，TA含量却显著降低。杜天浩等[22]用褪黑素处理盐胁迫下的番茄后发现外源褪黑素可以显著提高果实TSS含量，但TA含量会因为褪黑素处理的浓度有所差异，可能是因为本试验中所用的褪黑素浓度不宜用于提高果实的TA含量。

图1 贮藏期间果实可溶性固形物含量(A)和可滴定酸含量(B)Fig.1 Fruit soluble solid content (A) and titratable acidcontent (B) during storage注：不同字母表示在同一时期2组果实在P<0.05的水平上存在显著性差异。下同。

2.2.2 外源褪黑素对‘爱媛38号’Vc含量的影响

柑橘类水果是维生素C(Vitamin C，Vc)的重要供应来源，Vc能防止自由基的伤害，可提高人体免疫能力、防癌和机体应急能力，果实中的Vc含量是评价果实品质指标之一[23]。如图2所示，在贮藏期间Vc含量整体呈下降趋势，在贮藏10 d时，CK组的Vc含量高于MT组，随后CK组Vc含量迅速降低，而MT组缓慢增长，贮藏20 d时，CK组和MT组Vc含量为10.70、11.96 mg/100 mL。2组果实在贮藏40 d时Vc含量皆有所上升，在40～60 d时含量下降，至贮藏60 d时，CK组和MT组果实Vc含量分别为11.63、12.66 mg/100 mL，在贮藏20～60 d时，MT组果实显著高于CK组(P<0.05)。Vc是柑橘中主要的抗氧化物质之一[24-25]，当果实内部氧化胁迫加强而Vc合成相关酶活性减弱时，Vc与活性氧离子发生反应后其含量也会有所下降，褪黑素同样具有清除活性氧自由基的作用[26]。所以推测可能是外源褪黑素参与了与活性氧之间的反应后减少了Vc的损耗，从而提高了果实的Vc含量。

图2 贮藏期间果实Vc含量Fig.2 Fruit ascorbic acid content during storage

2.2.3 外源褪黑素对‘爱媛38号’呼吸强度的影响

呼吸强度反映果实内部营养物质的消耗与果实整体的衰老情况，果实在贮藏期间呼吸强度随着时间延长而下降，并且果实的呼吸作用是影响柑橘风味劣变的原因之一[27]。如图3所示，果实呼吸强度整体呈下降趋势。在贮藏10 d时，果实呼吸强度下降明显，CK组果实呼吸强度低于MT组，贮藏20 d时，CK组果实呼吸强度上升至9.17 CO2mg/(kg·h)，MT组下降至8.69 CO2mg/(kg·h)，随着贮藏期的延长，果实呼吸强度在40 d时有1个明显的减弱，随后在60 d时趋向平缓，在贮藏20～60 d期间，MT组呼吸强度一直低于CK组，在贮藏结束时，果实呼吸强度最低，此时CK组、MT组果实呼吸强度分别为5.86、4.49 CO2·mg/(kg·h)，贮藏期间2组果实的呼吸强度始终无明显差异(P>0.05)。辛丹丹等[28]报道了外源褪黑素处理可以抑制黄瓜贮藏过程中的呼吸速率，从而减少有机干物质的消耗，维护细胞膜的完整性，减缓了果实的衰老，褪黑素处理降低了‘爱媛38号’的呼吸强度，因此果实的衰老得以延缓，MT组果实在贮藏后仍维持了较好的新鲜度。

图3 贮藏期间果实呼吸强度Fig.3 Fruit respiration intensity during storage

2.3 外源褪黑素对‘爱媛38号’乙醇代谢的影响

2.3.1 Real-Time qPCR测定

果实采后进行无氧呼吸时会促进内部乙醇的积累，乙醇生成的反应主要有两步[29]：丙酮酸作为底物经过丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化生成乙醛，乙醛再经过乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)催化生成乙醇[6]。当PDC、ADH的基因表达量比较低时，果实采后的乙醇、乙醛含量积累也会受到抑制[30]。由图4-A可知，在贮藏期间果实中PDC基因相对表达量呈上升趋势，CK组果实在贮藏前20 d时，PDC基因相对基因表达量趋于平稳状态，在贮藏20 d后CK组的PDC基因相对表达量开始上调，在60 d时CK组的PDC基因相对表达量是初始的2.70倍。而MT组在贮藏前40 d时的PDC基因相对表达量都比较稳定，在40 d时剧增，贮藏结束时MT组果实的PDC基因相对表达水平是初始的2.37倍，在40、60 d时，CK组的PDC基因相对表达水平显著高于MT组(P<0.05)。图4-B表明，在贮藏20 d时CK组果实ADH基因表达量最低，在20 d后ADH基因相对表达水平上调达到峰值，为初始的3.13倍，在贮藏结束时降至1.74倍。MT组果实在贮藏10 d时ADH基因相对表达量有所减少，随后在20 d时上升至1.05，显著高于CK组(P<0.05)，而后波动性上升，60 d时ADH基因相对表达量为初始的1.35倍，在40、60 d时，MT组果实的ADH基因相对表达量显著低于CK组(P<0.05)。SUN等[31]报道了褪黑素在番茄的花青素合成期间会促进PDC基因表达与果实成熟，同时也有研究[32]表明番茄采后用50 μmol/L褪黑素处理会使ADH基因表达上调，这可能是由于褪黑素在植物不同阶段起的生长调节作用不同，同时推测不同植物对褪黑素的感受机制可能存在差异性。

图4 贮藏期间PDC(A)、ADH(B)的基因表达量Fig.4 Relative expression of PDC(A) andADH (B) during storage

2.3.2 外源褪黑素对‘爱媛38号’PDC、ADH酶活性的影响

PDC、ADH的酶活性升高会促进乙醛、乙醇的生成[33]。由图5-A可知，果实的PDC酶活性在贮藏期间先下降后上升，在贮藏40 d后趋向平缓。在贮藏20 d时,CK组、MT组果实PDC酶活性最低，分别为9.02、8.08×10-3U/(g·FW)，随后二者酶活性差距逐渐缩小，在60 d时，PDC酶活性基本相同。贮藏期间，MT组果实PDC酶活性始终低于CK组，差异不显著。由图5-B可知，在贮藏期间CK组果实ADH酶活性呈波动性下降趋势，MT组果实在贮藏前20 d酶活性下降迅速，随后逐渐趋向平稳。在贮藏10 d时CK组果实ADH酶活性显著高于MT组，随后CK组和MT组果实ADH酶活性下降，在20 d时2组果实ADH酶活性最低。在20～60 d，CK组先上升随后下降，而MT组果实ADH酶活性缓慢上升，在贮藏期间CK组果实的ADH酶活性始终高于MT组，并在10、40 d时差异显著(P<0.05)。乙醛、乙醇积累时通常伴随着PDC、ADH酶活性的提高[34]，而外源褪黑素处理可以使果实的PDC、ADH酶活性降低，可以抑制丙酮酸向乙醛、乙醇转化。

图5 贮藏期间PDC酶活性(A)、ADH酶活性(B)变化Fig.5 Changes in PDC enzyme activity (A) and ADHenzyme activity (B) during storage

2.3.3 外源褪黑素对‘爱媛38号’丙酮酸、乙醛和乙醇含量的影响

植物在呼吸作用时会先通过糖酵解将糖氧化分解生成丙酮酸[35]，在无氧呼吸作用下，丙酮酸会向乙醛、乙醇转化而减少其含量。由图6-A可知，2组果实的丙酮酸含量一直处于波动状态，并且在0～20 d时波动最大。CK组与MT组果实丙酮酸含量在贮藏10 d时最低，分别为31.08、33.04 μg/g，在20 d时剧烈增长至50.04、60.60 μg/g，此时果实丙酮酸含量达到最高值，2组间差异显著(P<0.05)。在20～60 d果实丙酮酸含量先减少后增加，40 d时MT组果实丙酮酸含量显著高于CK组(P<0.05)，在贮藏结束时丙酮酸含量上调，2组间差异不显著，且贮藏期间MT组果实丙酮酸含量始终高于CK组。推测可能是因为PDC、ADH基因表达受到抑制后，酶活性降低，丙酮酸向乙醛、乙醇的转化受到抑制，导致丙酮酸含量上调。

果实内部的乙醇代谢直接影响乙醇和乙醛的积累水平，而且柑橘在贮藏期间，果实中的乙醇、乙醛浓度会随贮藏期延长而不断变化[36]。如图6-B可知，贮藏期间果实中的乙醛含量整体呈上升趋势。在10～20 d时CK组果实乙醛含量先上升后下降，在20 d时为0.03 mg/g，随后乙醛含量持续上升，至贮藏结束时，达到0.10 mg/g；贮藏前40 d时MT组果实乙醛含量一直增加，贮藏结束时缓慢降至0.06 mg/g，40 d时，MT组果实乙醛含量显著高于CK组(P<0.05)，但CK组在贮藏后期增长剧烈，贮藏60 d时，CK组果实乙醛含量是MT组的1.58倍。如图6-C所示，贮藏期间果实的乙醇含量先上升随后下降，随后持续上升，总体呈波动上升的状态。贮藏10 d时，CK组、MT组果实乙醇含量分别0.47、0.28 mg/g，在20 d时下降至0.33、0.25 mg/g，在20～40 d时2组乙醇含量均增长了约0.1 mg/g，在贮藏40 d后，CK组果实乙醇含量增长剧烈，在贮藏结束时达到0.89 mg/g，约为MT组的2.09倍，在贮藏期间，2组果实间的乙醇含量均有显著差异(P<0.05)。研究表明，与常温贮藏相比，低温贮藏能够显著减少柑橘果实中乙醇的积累量[37]，而在本研究中，采后褪黑素处理能够进一步减少柑橘在低温贮藏过程中乙醇的积累。

图6 贮藏期间果实的丙酮酸(A)、乙醛(B)和乙醇(C)含量Fig.6 Contents of pyruvate (A), acetaldehyde (B) and ethanol (C) during storage time

3 结论

综合以上结果表明，‘爱媛38号’果实经过褪黑素处理后，能够显著提高贮藏期果实的新鲜度，果实风味也得到一定改善。在贮藏结束时，经褪黑素处理后的果实与对照组相比,可溶性固形物含量提高了0.45%，Vc含量提高了1.37 mg/100 mL，并且褪黑素处理果实后可以抑制果实的呼吸强度，减少可滴定酸含量从而提高果实的固酸比。测定发现‘爱媛38号’经褪黑素处理后果实中PDC、ADH的酶活性和基因相对表达量会受到抑制，导致丙酮酸含量累积，乙醛、乙醇含量减少。在贮藏60 d后，经褪黑素处理过的果实与对照组相比乙醇含量减少了52.21%，乙醛含量减少了36.85%。由此可见，使用质量浓度为1.0 g/L的褪黑素溶液处理‘爱媛38号’可以延缓果实衰老，提高果实贮藏期品质，并通过抑制PDC和ADH两个基因相对表达量进而降低酶活性,最终减少乙醛、乙醇的积累，延缓贮藏期间柑橘果实异味的产生。