苹果多酚处理后冰鲜大黄鱼贮藏期间品质与水分迁移的变化

王蒙，蓝蔚青,2,3,4*，邱泽慧，傅子昕，巩涛硕，谢晶,2,3,4*

1(上海海洋大学 食品学院，上海,201306) 2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海,201306)3(上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海,201306)4(食品科学与工程国家级试验教学示范中心(上海海洋大学)，上海,201306)

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)又名黄花鱼，属鲈形目石首鱼科海产经济鱼类，其肉质细嫩鲜美，营养丰富，是我国经济鱼类之一[1]。然而，其为多脂鱼，易发生脂肪氧化酸败，同时在贮藏期间还易受到微生物与酶的作用，易发生腐败变质，货架期相应缩短。

近年来，随着抗氧化剂在冷却肉中的广泛应用，天然植物抗氧化剂逐渐引起人们的关注。国内外科研人员现已研究了植物提取物对水产品的保鲜作用，如花椒叶[2]、迷迭香[3]、葡萄籽等提取物[4]，为植物源提取物的开发利用提供了良好的研究基础。苹果多酚(apple polyphenols, AP)是苹果果实在生长发育期间产生的次生代谢物。其主要成分为单环酚酸、黄烷-3-醇类、原花色素类、黄酮醇类、二氢查尔酮和花色苷等化合物[5]。据荷兰、美国等营养学家调查，苹果是继茶与洋葱后的第3大酚类物质膳食来源，具有良好的应用前景。其中，前期报道提及的苹果多酚已被用于鱼的抑臭试验，取得了良好效果[6]。夏凡[7]研究发现苹果多酚能有效延长真空包装冷却猪肉的货架期；SUN等[8]研究得出壳聚糖-苹果多酚膜可作为包装材料，延长冷藏草鱼片的货架期。目前苹果多酚在水产品保鲜应用处于起步阶段，基于此，本研究将不同浓度的苹果多酚用于冰藏大黄鱼片保鲜处理，通过贮藏期间的理化指标(pH值、色差、TBA值、TVB-N值、总巯基含量、持水率)、微生物指标(菌落总数、嗜冷菌数)与感官分析，并结合低场核磁共振和核磁成像技术，以综合评价不同浓度苹果多酚对冰藏大黄鱼品质与水分迁移变化的影响，从而为植物源提取物在水产品保鲜中的应用研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验原料

新鲜大黄鱼购于上海浦东新区芦潮港海鲜批发市场，重量为(500±50) g，体长为(340±20) mm，选择体态匀称，鳞片完整且紧贴，鱼鳃鲜红清晰、眼球饱满的黄鱼。购后立即置于碎冰上，层冰层鱼处理，30 min内运至试验室进行试验。

1.2 主要药品试剂

苹果多酚(食品级，纯度≥98%)，上海维编科贸有限公司；蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所；平板计数琼脂(plate count agar, PCA)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；轻质氧化镁、硼酸、95%(体积分数)乙醇溶液、NaCl、NaOH、HCl、石油醚、乙酸、异辛烷、KI、硫代硫酸钠、三氯乙酸(trifluoroacetic acid, TCA)、2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)、氧化镁、硼酸、甲基红/蓝、Tris试剂、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝、溴苯酚蓝等(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器设备

FE20型pH计，梅特勒-托利多(上海)有限公司；CR-400型色彩色差计，日本柯尼卡美能达(中国)仪器有限公司；H-2050R型台式高速低温离心机，湖南湘仪试验室仪器开发有限公司；Kjeltec8400型凯氏定氮仪，丹麦FOSS中国上海有限公司；JX-05拍打式无菌均质器，上海净信实业发展有限公司；AUW320型分析天平，日本岛津公司；DHG-9053A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；LDZM-40KCS-Ⅲ立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；VS-1300L-U型超净台，苏净安泰集团；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Meso MR23-060H-I型核磁共振分析及成像系统，上海纽迈电子科技有限公司；Synergy2型自动酶标仪，美国BioTek公司。

1.4 原料处理

将新鲜大黄鱼去头、去尾、去内脏并清洗后随机分成4组，每组14条鱼。参考文献[9-10]及前期预试验，将样品分别置于0.25、0.50、1.00 g/L的AP液中，以无菌水处理为对照组(CK)。样品浸渍处理15 min后沥水，随机装入PE保鲜袋内，辅以层碎冰层鱼，模拟超市商品陈列方式，将其置于4 ℃贮藏，分别于0、2、4、6、8、10、12、14 d进行相关指标测定。

1.5 试验方法

1.5.1 pH值

根据李颖畅等[11]方法测定pH值。称取5 g鱼肉，加入45 mL蒸馏水，均匀静置30 min后过滤，取滤液测定其pH值，每个样品重复测定3次，取平均值。

1.5.2 色差

参考THIANSILAKUL等[12]方法测定其色泽。使用色差计对样品表面进行检测，得到L*和b*，其中L*表示亮度值，b*表示黄度值。每个样品选取5个位点进行检测，并加以标记，尽量使样品间测定位点一致，减小误差。取5个位点的平均值作为其色差值。

1.5.3 TBA值

参考SANCHEZ-ALONSO等[13]方法，称取鱼肉5.00 g加入50 mL离心管，随后加入25 mL 200 g/L的TCA，均质后静置1 h，经4 ℃，8 000 r/min离心10 min后过滤，用蒸馏水定容至50 mL，取滤液5 mL加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液混匀，沸水浴20 min，冷却后在532 nm处用分光光度计测定其吸光度(A)。结果以1 kg鱼肉中产生的丙二醛(malondialdehyde, MDA)质量(mg)计，即单位为mg/kg。根据吸光度A和标准曲线计算TBA值。

1.5.4 TVB-N值

根据邓辉萍[14]方法略有修改，称取大黄鱼肉5 g，利用全自动凯氏定氮仪进行样品TVB-N值测定，平行测定3次，结果以mg N/100 g表示。

1.5.5 总巯基含量

根据巯基测定试剂盒进行分析，先配制标准应用液，以肌动球蛋白溶液为待测样本。使用总巯基测定试剂盒说明书的方法计算总巯基含量。

1.5.6 菌落总数与嗜冷菌数

参照GB 4789.2—2016[15]进行测定。称取10 g鱼肉于灭菌袋中，加入90 mL 0.85%(质量浓度)无菌生理盐水，拍打均匀，以10倍梯度稀释，取3个合适的稀释度，各取1 mL于无菌培养皿内，每个稀释度作3个平行，以不添加灭菌稀释液作对照试验。平板分别在(30±1) ℃培养(72±3) h，(4±1) ℃培养10 d后计算菌落总数与嗜冷菌数，结果以lg CFU/g表示。

1.5.7 感官分析

根据AOAC[16]规定，并结合GB/T 18108—2008[17]和SC/T 3101—2010[18]，进行新鲜大黄鱼鱼肉的感官指标制表，具体评分标准见表1。

表1 大黄鱼感官评价表Table 1 Sensory evaluation standards of Pseudosciaena crocea

感官评定人员由6名经过专门训练的试验人员组成，各指标评分为5时表示样品品质最佳，评分下降则表示鱼肉块品质劣变[19]，各项得分低于2则视为感官排斥点。

1.5.8 持水率

参考李长乐等[20]方法并稍作修改，取3 g样品放在滤纸中包裹，置于离心管中，在3 000 r/min下离心10 min，沥干体表水分称量质量，重复3次，取平均值。持水率计算方法如公式(1)所示：

(1)

1.5.9 低场核磁共振与核磁成像分析

按照CAO等[21]方法测定稍有修改。将鱼肉切成2 cm×2 cm×1 cm鱼块。擦干样品表面水分，称重，保鲜膜包裹后，将其放入核磁管(15 mm×200 mm)中并置于分析仪中。共振频率为100 kHz。重复扫描次数为4，回波个数为8 000，通过(Carr-Purcell-Meiboom-Gill, CPMG)脉冲序列采集样品横向弛豫时间(T2)。2次连续扫描之间的重复时间为3.5 s，脉冲间的τ值为150，μs为90°和180°。T2分布通过MultiExp Inv分析软件获得。CPMG测试后的样品进行MSE序列成像测试，运用MRI成像软件及MSE多层自旋回波序列采集样品冠状面质子密度像。

1.6 数据处理

每个样品设3个平行，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，试验数据采用ANOVA进行邓肯氏(Duncan’s)差异分析，结果以平均值±标准偏差表示，P<0.01为极显著，P<0.05为显著，P>0.05为不显著，并使用Orgin 8.5绘图。

2 结果与分析

2.1 pH值

水产品在贮藏期间，其pH通常呈先降后升趋势，其原因可能由于水产品死后会经历僵直、解僵、自溶及腐败阶段。在初期僵直阶段，其体内糖原发生糖酵解反应，产生乳酸、磷酸等酸性物质，使pH值下降[22]；随着贮藏时间的延长，鱼体蛋白酶分解及微生物作用产生氨及胺类物质，导致pH值升高[11]。

如图1所示，贮藏初期，所有组别样品均呈下降趋势，可能由于鱼体此时正处于僵直阶段。第2天后，各组样品的pH值逐渐升高，反映其品质劣变。其中，经苹果多酚处理后大黄鱼pH值的升幅缓于CK组，可能是由于苹果多酚的酚羟基会游离出H+，使处理组样品的pH值上升速度减缓[23]。其中，AP3组样品的pH值明显低于其余各组。

图1 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼pH值变化影响Fig.1 Effects of apple polyphenols on the change of pHvalue in Pseudosciaena crocea during ice storage

2.2 色差

水产品在贮藏期间，色泽易发生改变，因此色差值可作为评价鱼肉品质与鲜度的重要指标之一[24]。

由表2可知，各组别在贮藏期间的L*值差异显著(P<0.05)。与CK组相比，AP处理组样品的L*值略高，不同AP组间总体变化趋势一致，其中AP2组的L*值在第14天略高于AP3组，可能由于多酚类黄酮化合物的降解使AP组样品的L*值增高[25]。而AP各组间的b*值差异不明显(P>0.05)，可见苹果多酚具有一定的护色作用，能延缓大黄鱼冰藏期间的色泽改变，本研究结果与SHI等[26]一致。同时，微生物增殖与脂肪氧化也会影响其色泽变化，细菌生长过程中的副产物如H2S与H2O2等，其可结合不稳定蛋白，从而生成呈色蛋白使肉色改变。此外，脂肪也会因其发生氧化而使肉色变暗[7]。

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表2 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼色差变化影响Table 2 Effects of apple polyphenols on the change ofL* and b* value of Pseudosciaena crocea during ice storage

注：表中数据为样品的“平均值±标准差”(n=3)；同一列中的不同字母表示差异显著(P<0.05);“-”表示未检出。

2.3 TBA值

大黄鱼中的不饱和脂肪酸，在贮藏期间易氧化酸败，经氧化分解后产生的MDA，其会与TBA试剂发生颜色反应[27]。因此，TBA值可用于评价鱼类贮藏过程中的品质变化。

由图2可知，各组样品的TBA值随贮藏期的延长而逐渐升高，表明其氧化加剧。其中，CK组样品的TBA值在冰藏12 d后增至1.94±0.236 mg/kg，鱼肉已发生酸败。其中，AP3组样品的TBA值变化幅度最低，其在冰藏期间均未超过1.5 mg/kg，与AP2组无显著差异(P>0.05)。可能由于多酚由1个或多个带有极性羟基(—OH)的疏水性芳香核组成，能提供大量的活性羟基，对样品脂质中游离自由基抑制或清除作用较强，能有效抑制脂肪酸败，延长其货架期[28]。王丹丹等[29]研究发现，茶多酚能有效抑制带鱼片脂肪的氧化酸败，这与本研究结果一致。也与SUN等[8]研究结果相似。

图2 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼TBA值变化影响Fig.2 Effects of apple polyphenols on the change of TBAvalue in Pseudosciaena crocea during ice storage

2.4 TVB-N值

TVB-N值是评价水产品腐败变质的指标之一，反映水产品中蛋白质因微生物与内源性酶作用分解蛋白质和非蛋白物质，积累的具有挥发性的氨二甲胺与三甲胺等低级胺类含量[30]。据SC/T 3101—2010鲜冻大黄鱼标准[18]，TVB-N值≤13 mg/100 g为一级鲜度，13 mg/100 g

由图3可知，随着贮藏时间延长，样品的TVB-N值呈先缓升后加速上升趋势，变化过程与TBA值相似。第0天，样品的TVB-N值达(10.69±0.114) mg/100 g，处于一级鲜度。贮藏初期，各组样品的TVB-N值缓增，无明显差异(P>0.05)。冰藏第6天时，CK组样品的TVB-N值达(13.13±0.58) mg/100 g，超过一级鲜度，此时AP1组样品的TVB-N值上升加速；第10天后，AP2与AP3组样品的TVB-N值迅速增加，结合TBA值分析可见大黄鱼在第10天时品质明显劣变；第12天时，CK组样品的TVB-N值达(32.90±1.655) mg/100 g，超出二级鲜度。AP3组样品的TVB-N值在第14天后才增至(32.04±0.626) mg/100 g，超出鲜度限值。表明苹果多酚处理能有效抑制鱼肉中的蛋白质变性，一定程度上延缓其腐败。魏胜华等[31]研究发现黄酮类化合物对微生物有抑制作用，降低其脱氨脱羧反应，减少含氮类化合物的生成。

图3 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼TVB-N值变化影响Fig.3 Effects of apple polyphenols on the change ofTVB-N value in Pseudosciaena crocea during ice storage

2.5 总巯基含量

总巯基含量反映了样品中的蛋白质变性聚合程度，是肉制品中蛋白质氧化的标志之一[32]。其主要由于样品在冰藏过程中，其肌原纤维蛋白分子构象发生变化，暴露于蛋白质表面的半胱氨酸残基氧化成二硫键，使总巯基含量相应减少[33]。

由图4可知，第0天时，大黄鱼样品的总巯基含量为(78.68±1.615) nmol/mg。随着贮藏时间延长，各组样品的总巯基含量呈递减趋势，这是由于冰藏期间，鱼肉中的肌原纤维蛋白结构改变，使分子内部的巯基暴露，其在内源酶的作用下发生降解，且易发生氧化并与二硫化物置换，使巯基含量减少[34]。其中以CK组降幅最明显，AP1、AP2与AP3组样品总巯基含量的下降趋势有所减缓。贮藏末期，CK、AP1、AP2与AP3组样品的总巯基含量分别为初期的28.30%、33.34%、36.49%与37.17%，可见苹果多酚能延缓样品中总巯基含量的下降。RAMIAREZ等[35]提出抗氧化剂能与蛋白质结合，减缓其氧化降解。

图4 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼总巯基含量变化影响Fig.4 Effects of apple polyphenols on the change ofsulfhydryl content in Pseudosciaena crocea duringice storage

2.6 菌落总数与嗜冷菌数

参照相关文献[36]可知，菌落总数<104为一级鲜度；104≤菌落总数<106为二级鲜度；菌落总数>106为鱼肉腐败。

由图5可知，贮藏初期，样品的TVC值与PBC值分别为(3.71±0.014) lg CFU/g与(2.87±0.120) lg CFU/g，处于一级鲜度。随着贮藏时间的延长，各组样品的微生物指标均呈递增态势。其中，CK组样品的TVC值在第8天时达(6.84±0.078) lg CFU/g，超出鲜度限值；此时，AP1、AP2与AP3组样品的TVC值分别为(6.28±0.050) lg CFU/g、(6.14±0.120) lg CFU/g与(5.55±0.007) lg CFU/g，表明苹果多酚对微生物生长有较好的抑制作用。样品PBC值的变化趋势与TVC类似，CK组样品在贮藏期间的PBC值增幅明显快于AP组，其在第6天时超出鲜度限值，而AP1、AP2与AP3组则分别在第8、10与12天时才达到腐败阶段。可能由于酚类化合物能导致菌体细胞膜损伤，对其生长代谢造成影响[37]。

图5 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼菌落总数(a)与嗜冷菌数(b)变化影响Fig.5 Effects of apple polyphenols on the change ofTVC(a) and PBC(b) in Pseudosciaena crocea duringice storage

2.7 感官分析

鱼和鱼类产品在贮藏过程中的直观可接受性取决于其感官变化，也决定了消费者的购买意愿。大黄鱼在冰藏期间的感官变化如图6所示。

a-黏性；b-气味;c-质地图6 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼感官分值变化影响Fig.6 Effects of apple polyphenols on the change of sensory evaluation in Pseudosciaena crocea during ice storage

由图6可知，随着贮藏时间的延长，大黄鱼样品的黏性、气味与质地均有所下降。贮藏前4 d时，各组样品的黏性和质地变化无明显差异(P>0.05)。但在贮藏6 d后，CK组样品体表黏液明显增多且浑浊，腥味加重，腐败气味明显。对质地而言，各组样品变化无明显差异(P>0.05)，但在贮藏末期呈松软状态。CK组样品在贮藏末期腐败气味明显，质地松软，体表发黄，而AP处理组样品仍在可接受范围。

2.8 持水率

持水率可反映样品中蛋白质的网络结构，其凝胶结构越均匀致密，样品的持水率则越好[38]。不同苹果多酚对冰藏大黄鱼持水率变化影响如图7所示。

图7 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼持水率变化影响Fig.7 Effects of apple polyphenols on the change of waterholding capacity in Pseudosciaena crocea during ice storage

由图7可知，大黄鱼在贮藏初期无显著差异(P>0.05)，从第6天起，各组样品的持水率急速降低，AP处理组样品持水率降幅低于对照组。与初始值相比，第12天时，CK、AP1、AP2与AP3组样品的持水率分别下降了12.08%、10.72%、9.17%与8.72%，表明苹果多酚能抑制鱼肉持水率的下降。可能由于多酚含有丰富的活性羟基，能与鱼肉蛋白较好结合，从而截留更多水分[39]。其中以AP3组样品的持水率最高，表明其保水性能最佳。

2.9 低场核磁共振与核磁成像分析

近年来，低场核磁共振(LF-NMR)和核磁成像(MRI)技术已成为表征食品加工贮藏过程中水动力变化的有效工具[40]。LF-NMR弛豫时间T2谱图的结果可在一定程度上反映肌肉中水分分布、迁移情况以及肌原纤维蛋白完整性。如图8所示，各组中T2的弛豫时间谱图均显示出3个峰，分别对应3种水分相态，其中T21峰(0.01～10 ms)，主要涉及与大分子紧密结合的水；T22峰(10～200 ms)，与具有高度组织性的蛋白质结构内部的水有关；T23峰(>200 ms)，对应于蛋白质结构外部的水。

图8 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼弛豫时间变化影响Fig.8 Effects of apple polyphenols on the change of transverse relaxation time in Pseudosciaena crocea during ice storage

由图8可知，随着贮藏时间的延长，各组样品T21无明显变化，T22和T23逐渐右移且弛豫时间增加，T22处对应的峰面积呈缓慢下降趋势，表明水分流动性增大，水分子更自由。

由核磁共振反演软件得到的峰面积结果可计算出肉中不同状态水分所占的比例(pT21(%)、pT22(%)、pT23(%))。4种浓度的苹果多酚对大黄鱼各组分水分变化影响如表3所示。

表3中，pT22占最大比例，表明样品中最主要水分为肌原纤维网络中的水。随着贮藏时间延长，pT22逐渐降低，而pT23逐渐升高，表明与蛋白质紧密结合水向自由水转变。AP3处理组总体保持最大峰面积比例，说明水分子与大分子结构结合效果最紧密且优于其他组，苹果多酚降低了鱼体内的自由水流动，与持水率结果一致。

核磁成像伪彩图中的红色表示1H质子(H2O)质子密度高，该部分的水含量越高，蓝色表示水含量最低，通过信号颜色变化反映样品中水分含量及迁移规律[41]。结果显示，大黄鱼新鲜鱼肉中非结合水流动性较强，整体呈红色。在整个贮藏期间，其水分变化明显，随着贮藏时间的延长，样品图像逐渐趋于蓝色，表明样品表面水分逐渐增多。其中，CK组鱼肉中的红色区域逐渐变小，第6天变成黄色。而AP处理组样品的颜色转变速度较CK组慢，AP3组直到第12天仍呈浅红色，可见其水分流失最少，该研究结果与前期持水率变化结果相似。水分迁移规律也与车旭[42]将植物源保鲜剂作用于鲳鱼的低场核磁测定结果一致。

表3 苹果多酚处理对冰藏大黄鱼各组分水分的百分含量pT2i变化 单位：%

3 结论

试验研究了不同浓度苹果多酚对冰藏大黄鱼贮藏期间品质、蛋白质特性与水分迁移变化影响。结果表明，AP处理组样品的pH值、TBA值、TVB-N值与微生物指标均明显低于CK组，表明苹果多酚具有较好的抗氧化与抑菌效果。通过总巯基含量、持水率与低场核磁共振分析得出，AP处理组的蛋白质结构稳定性与持水能力均较CK组好。AP浸渍处理能在一定程度上延缓大黄鱼鱼肉的腐败变质，其中以1.00 g/L苹果多酚(AP3)处理组效果最佳。综合各评价指标，苹果多酚处理能延长大黄鱼的冰藏货架期2～4 d。