检测ONOO-类的近红外荧光探针

黄丽娜（云南师范大学，云南 昆明 650500）

过氧亚硝酸盐（ONOO-）是生命系统中内源性产生的活性氧（ROS）之一，它是通过超氧自由基（O2·-）和一氧化氮（NO）在体内偶联反应生成的[1]。由于ONOO-是强的生物氧化剂，因此反应活性很高，表现出不稳定性，但是它在信号转导中起着至关重要的作用，并且还表现出抗菌和抗菌活性[2]。ONOO-在生物体内的含量过高或过低都会导致许多疾病，比如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、炎症等[3]。另外，ONOO-会引起许多细胞受损，包括DNA 和蛋白质[4]。因此，开发具有高选择性、高灵敏度，生物相容性好以及能够特异性识别的方法来检测ONOO-至关重要。然而，由于ONOO-也存在一些缺陷，如半衰期短（＜10ms），活性高，浓度低、在体内难于被捕捉等[5]。所以，检测生物体内ONOO-也成为了巨大的挑战。尽管已经使用了许多方法来检测ONOO-，但是具有荧光探针的荧光成像技术由于易于操作，高灵敏度和选择性以及原位检测而受到越来越多的关注[6，7]。

目前，尽管已经有许多方法ONOO-进行检测，但是却存在着许多缺陷，而荧光成像技术具高灵敏度、高选择性、操作简单及原位实时检测等优点。近红外荧光探针分子由于具有高度共轭多烯的结构，具有近红外吸收和发射光谱、低背景荧光，组织穿透力强、抗干扰能力强，对细胞损伤小。另外，近红外荧光探针主要是基于优异的荧光团（如菁染料、半菁染料、苯并吡喃腈、香豆素、罗丹明、氟硼吡咯等）来检测ONOO-。

1 近红外荧光分子探针用于检测ONOO-

2013年，Han课题组基于氟硼吡咯荧光团设计合成了一个基于分子内电荷转移（ICT）的比率荧光探针[8]。当加入ONOO-后，探针在680nm 处逐渐增强，而在572nm 处的逐渐减弱，表现出了比色变化。该探针具有优异的选择性、高的灵敏度和抗干扰性，检测限低至5μM。因此，该探针被应用于RAW264.7细胞中的ONOO-的检测。

2014 年，James 课题组报道了一种检测内源性ONOO-的荧光探针[9]。该探针是基于萘酰亚胺荧光团和硼酸盐设计的。在单糖（例如D-果糖）存在下，荧光信号增强，而在过氧亚硝酸盐的存在下，与D-果糖结合时探针的荧光被关闭，并且ONOO-显示了较高的选择性。更重要的是，该探针已经成功用于在RAW264.7和HeLa细胞中内源性及外源性ONOO-的检测。

2016 年，Qian 课题组设计合成了一个基于FRET 的小分子比率荧光探针[10]。该探针由Cy3 和Cy5 两种菁染料组成，用于检测ONOO-。以530nm 为激发波长，探针满足Cy3 的FRET 机理，在660nm处显示Cy5的荧光。当加入ONOO-后，在560nm处显示荧光增加，在660nm 处的荧光减弱，这是由于ONOO-选择性氧化了Cy5荧光团。该探针具有很好的选择性和高灵敏度，可定量检测活细胞中的ONOO-。

2017 年，Ma 课题组设计合成了一种以罗丹明为荧光团的荧光探针用于检测ONOO-[11]。该探针是通过对罗丹明结构进行修饰，通过连接三苯基膦和苯肼来构建，探针本身几乎没有荧光，当加入ONOO-后，在波长550nm 显示强烈的吸收，同时，溶液的颜色由无色变为粉红色。以550nm为激发波长，探针在578nm显示最大的发射峰，并且荧光增强近80倍。这是由于苯肼被ONOO-氧化，将罗丹明荧光团释放出来。探针的检测限为55nM，且选择性高于其他ROS。更重要的是，该探针不仅可以广泛应用于检测线粒体的中ONOO-还可以用于与ONOO-相关疾病的诊断。

2018 年，Tang 课题组设计合成了一个用于检测线粒体中ONOO-的双光子近红外荧光探针[12]。该探针以香豆素衍生物作为荧光团与对硝基苯基碳酸酯作为供体连接。在探针溶液中加入ONOO-后，氨基被还原，此时发生PET过程，荧光恢复。从光谱可以看出，探针在570nm处有最大吸收，630nm处出现最大荧光发射，并且具有较高的荧光量子产率。该探针能够特异性识别、具备高灵敏度和能够快速响应ONOO-的性质，并且这些特性表面了探针能够在心肌细胞和心脏组织中监测线粒体ONOO-的浓度变化并对其进行成像。

2018年，Yoon课题组设计合成了一个双光子荧光探针用于监测细胞和组织中的ONOO-[13]。该探针是以NMDA 受体抑制剂和拮抗剂作为靶向NMDA受体的一部分，硼酸作为反应位点监测来ONOO-。该探针检测ONOO-的水溶性较好，在最短时间内能够快速响应，表现出较高的选择性和灵敏度，成为研究与神经系统中ONOO-相关疾病的有用的成像工具。

2019年，Feng课题组设计合成了一种用于检测生命系统中外源性和内源性ONOO-的可靶向溶酶体的荧光探针[14]。该探针能够快速响应（25μs）、高灵敏度（检测限为16nM）、高的选择性和低毒性。更重要的是，该探针可靶向溶酶体，用于对活细胞中的溶酶体ONOO-成像。

2019 年，Liu 课题组基于苯并吡喃腈荧光团设计合成了一种用于特异性检测ONOO-的荧光探针[15]。探针在470nm 处有最大吸收峰，在630nm 处出现最大发射峰，同时具有较大的斯托克斯位移（160nm）。当加入ONOO-后，探针中的酰胺键断裂，分子内电荷转移（ICT）和光诱导电子转移（PET）过程增强，苯并吡喃腈的荧光被恢复。此外，该探针具有较好的生物相容性和选择性，因此，可用于检测内源性ONOO-浓度并在巨噬细胞中进行成像。

2 结语

近红外荧光探针由于具有深层的组织穿透能力和对细胞损伤小的优点，尤其是还可以检测生物体内的活性氮和活性氧。为此，已经越来越受到人们的关注。这篇文章基于优异的荧光团设计合成了低检测限、高灵敏度和高选择性的用于检测ONOO-的近红外荧光探针，所设计的这些探针已成功应用于活细胞和组织中。另外，近红外荧光探针成像技术已逐渐应用到了医学领域，成为今后开发用于体内和体外检测活性氮和活性氧的荧光探针的有利的工具。