CAR T细胞治疗在血液恶性肿瘤中的进展与挑战

王 瑶 韩为东 (中国人民解放军总医院生物治疗科，北京 100853)

CAR分子由识别抗原的单链抗体(scFv)与T细胞活化域(通常包括CD3 Zeta链)组成[1-3]。这些分子通过逆转录病毒或者慢病毒等基因工程手段整合到T细胞上。第一代CAR仅具有一个CD3 Zeta信号域而缺少T细胞持续应答[4，5]。而第二代CAR具有CD3 Zeta信号域以及其他共刺激分子(通常为CD28或者4-1BB)，使CAR T暴露于抗原后能够有效地扩增[6]。第二代CAR结构的持久性成为当前CAR T细胞“活体药物”产生的基础[4]。CAR被设计成与特定抗原结合，引发CAR T细胞活化，而没有传统上由特异性T细胞受体和主要组织相容性复合物(major histocompatibility complexes，MHC)赋予的双重限制[7,8]，由于其识别不受MHC限制的独立性使之具有与T细胞或TCR T完全不同的抗肿瘤优势。现已证明，靶向CD19抗原的CAR T细胞具有较高的诱导缓解率[9]。除了B细胞恶性肿瘤之外，CAR T最新在骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤以及CLL等恶性血液肿瘤中的进展也同样迅速。此外，针对CD19靶点CAR T治疗的后续问题也逐渐暴露，立足于解决CAR T治疗后复发和CAR T本身效能不足引起的疗效欠佳的临床问题，国际上同样有很多最新的研究结果。 这里，我们总结了CAR T在多种血液恶性肿瘤治疗中的进展和更新，仍然存在有待克服的挑战。

1 B型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)

2012年4月，首个B-ALL的儿童被实施靶向CD19的CAR T(CAR T-19)细胞治疗[10,11]，尽管出现了威胁生命的细胞因子释放综合征，但该儿童仍获得了持续完全缓解(>6年)。随后，CAR T-19细胞在治疗复发和/或难治的表达CD19的B细胞恶性肿瘤的早期试验中取得了空前的成功，许多患者获得了长期缓解并可能治愈[12-14]。美国FDA批准了两种不同的抗CD19 CAR T细胞产品用于治疗B-ALL和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，分别是包含4-1BB共刺激分子的Tisagenlecleucel(tis-cel)(kymriah,诺华)和包含CD28共刺激分子的axicabtagene ciloleucel(yescarta,凯特)。CAR T细胞疗法的出现改变了复发难治性(R/R)B-ALL的治疗模式，将成人R/R ALL的完全缓解(CR)率从传统治疗方法的29%(18%～44%)提高到80%以上[15-17]。最新关于tis-cel的多中心数据显示[16]，治疗ALL的整体CR率为81%，报道时尚未达到中位生存期，CAR T在患者体内持续存在超过20个月。而包含另一种共刺激分子CD28的CAR T-19治疗53例R/R ALL，CR率为83%，整体中位生存期(OS)为12.9个月，其中骨髓原始白血病细胞<5%患者的OS为20.1个月。毫无疑问，CAR T-19治疗B-ALL是迄今为止最成功的癌症治疗模型。对比两种不同共刺激分子，4-1BB的CAR T治疗的患者未观察到肿瘤负荷与疗效的线性关系，CD28的CAR T肿瘤负荷与预后相关。有研究提示4-1BB体现在体内持续存在时间的优势，CD28体现在更强更快速的细胞溶解能力[18,19]。但目前仍没有任何平行数据明确两种共刺激分子的CAR T临床治疗效果哪个更有优势。

与所有癌症治疗一样，CAR T细胞治疗也会产生相应的不良反应。①B细胞缺乏是CAR T-19治疗后最常见的不良反应，临床应用补充免疫球蛋白可以降低由于体液免疫缺失带来的不良后果，B细胞缺乏在体内CAR T-19消失后可恢复。②CRS是CAR T-19治疗后另一个常见并可预期的不良反应。在ALL治疗中发生率为29%～77%等，其严重程度与肿瘤负荷相关[20,21]，在CAR治疗后无临床反应的患者中并不常见。CRS的发作与CAR T细胞的药代动力学特征相关，发生时间与体内CAR T细胞的扩增峰值时间存在关联。严重情况下，CRS可发展为危及生命的毛细血管渗漏，同时伴有低氧和低血压；并与吞噬性淋巴细胞增生及巨噬细胞活化综合征有许多相同的特征[22]。妥珠单抗(Tocilizu-mab，Actemra)通常可有效治疗CAR T细胞诱导的严重CRS。③除CRS外，轻度到危及生命的神经毒性均有被报道，神经毒性的发生与白血病细胞是否有中枢系统浸润无关[23]。神经毒性在ALL的CAR T-19治疗中发生率约为40%(15%～60%)，可以从以轻度混乱、震颤和语言困难到完全性失语，癫痫、昏迷和脑水肿等多种形式表现出来。目前尚不清楚神经毒性引起的脑水肿是否是CRS的极端表现或者是独立于CRS的不良反应。但CAR T-19引起的神经毒性通常是可逆转的。虽然有研究表明单核细胞或内皮损伤可能与CRS发生有关，导致神经毒性发作，但由于缺乏研究CRS及神经毒性的动物模型，因此对CAR T细胞治疗引发不良反应的机制了解甚少。

为了获得长期的疾病缓解，一些研究中心将异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)作为CAR T-19治疗后的巩固疗法。有研究显示，CAR T细胞剂量水平较低(<1×105kg-1)可能是CAR T治疗后疾病迅速复发的原因，对于治疗剂量较低后桥接HSCT治疗的患者，OS明显优于未实施HSCT的患者[24]。而CAR T治疗获得深层MRD阴性缓解的患者，采用HSCT的后续治疗并不能提高生存率[17]；另一方面，HSCT也可能无法消除CAR T治疗后CD19阴性的ALL肿瘤细胞的增长[25]，因此CAR T治疗桥接HSCT是否有意义仍然存在争议。

CD22在B细胞和大多数B-ALL细胞表面广泛表达[26]，CAR T-19治疗后ALL细胞CD19丢失是治疗复发的常见机制，但CD19丢失后ALL细胞通常会保留CD22，因此靶向CD22的治疗是CAR T-19失败后或者预防CD19阴性复发的一个治疗策略。但临床试验结果显示，CAR T-19治疗复发并包含CD19弱/无表达的患者，单独CAR T-22有效率低于CAR T-19治疗，平均缓解期仅为6个月，CAR T-22治疗缓解时间与是否采用过CAR T-19治疗、CD19表达强弱以及能否达到MRD阴性缓解有相关性[27]。除了单独CAR T-22临床试验外，同时靶向CD19/CD22的双靶点CART和鸡尾酒疗法靶向CD19及CD22的CAR T细胞输注临床试验也在进行[23]。目前有关双靶点CAR T的临床试验结果摘要报道了临床安全性，相对高的细胞治疗剂量能够在短期内使患者获得CR。CAR T-22治疗的CRS和神经毒性发生率与CAR T-19治疗比较接近，由于没有完整的长期观察报道，治疗后是否会出现CD19和CD22双靶点阴性复发尚不明确。

2 B细胞型非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)

CAR T-19细胞对化疗难治性/侵袭性B-NHL同样产生了显著影响。自2010年首次报道CAR T-19在B-NHL中取得成功之后[28]，综合三个包括美国宾夕法尼亚大学、美国国家癌症研究所(NCI)以及美国斯隆凯瑟琳癌症中心开展的Ⅱ期临床试验结果，约40%的B-NHL患者可以通过CAR T-19获得持续完全CR[29-31]。三家机构的CAR T-19细胞产品分别是以NCI研究基础的axi-cel；宾夕法尼亚大学研究基础的tis-cel和斯隆凯瑟琳研究基础的liso-cel。其中axi-cel为CD28共刺激分子，而另外两个CAR T-19是4-1BB共刺激分子；与axi-cel和t-cel不同，liso-cel将最终CAR T-19中的CD4与CD8细胞比例人工定位到1∶1。Ⅱ期临床试验包括的肿瘤类型有弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)，高级别B细胞淋巴瘤(HGBL)，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBL)和转化型滤泡淋巴瘤(tFL)。axi-cel的治疗CR率为54%，中位PFS为5.9个月；t-cel的治疗CR率为40%，中位PFS仅为2.9个月；liso-cel的治疗CR率为59%。t-cel在ALL的治疗效果显著，在B-NHL中似乎疗效较弱于其他研究机构的CAR T-19；虽然其CR率较低，但体现了与众不同的持续性，超过80%的CR患者能够维持超过1年的完全缓解，50%首次治疗评价为部分缓解(PR)的患者，在一年内进一步获得了CR。除CD19靶点的CAR T治疗外，靶向CD20的CAR T细胞治疗同样在B-NHL中也获得了相似的CR率。来自中国解放军总医院的CAR T-20治疗B-NHL Ⅱa期的临床试验观察结果显示，治疗CR率为54%，中位PFS为10个月，最长一名患者持续缓解时间超过57个月，这也是全球范围内CAR T治疗报道的缓解时间最长的患者[32]。

与B-ALL的CAR T治疗一样，B-NHL采用CAR T-19或CAR T-20获得显著疗效的同时伴随着CRS和神经毒性的发生。不同临床试验显示出CRS的发生率为39%～77%，超过3级以上的CRS为1%～23%；神经毒性发生率为15%～68%，3级以上神经毒性发生率为1%～18%。不同于ALL的治疗，B-NHL的CAR T治疗还包括其他特殊的不良反应，包括毛细血管渗漏综合征、呼吸功能受损、消化道出血、溶瘤综合征等[31-33]。已有研究结果显示CAR T治疗前采用化疗淋巴细胞清除术会有效降低肿瘤负荷、CRS的发生程度以及延长疾病缓解时间。

虽然CAR T治疗针对复发难治型B-NHL获得40%～58%的CR率，但相比CAR T治疗ALL获得的超过80%的缓解率，CAR T在NHL的治疗中还有提升的空间。一方面，对于消化道占位、神经中枢占位以及超大肿瘤负荷的患者，由于CAR T治疗可能带来致命性的不良反应而被排除在外。另一方面，CAR T治疗后淋巴瘤的复发除了靶抗原丢失外还有CAR T细胞本身的耗竭。由于淋巴瘤具有类似实体肿瘤的肿瘤微环境，CAR T细胞更容易出现因为大负荷肿瘤抗原长期存在引发的耗竭，有临床试验开展CAR T细胞联合免疫检查点抑制剂治疗B-NHL以降低肿瘤的复发。今后对于B-NHL、CAR T的后续研究方向更多集中在提高疾病缓解率，降低肿瘤复发率和不良反应控制率上。

3 多发性骨髓瘤

CAR T治疗难治性多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是细胞治疗领域内另外一个研究热点。B细胞成熟抗原(BCMA；也称为TNFRSF17)在恶性浆细胞上高度均匀表达，同时BCMA的表达水平随着MM的发展而增加，因此BCMA是CAR T治疗MM的理想靶点[34,35]。2016年首次报道了靶向BCMA的CAR T细胞治疗MM临床试验结果，此研究开始于2013年，第一次证实了CAR T-BCMA对MM的有效性及安全性[34]。随后，CAR T-BCMA治疗MM的临床试验被多个中心开展。美国宾夕法尼亚大学报道的包含4-1BB共刺激分子的CAR T-BCMA显示联合高水平细胞剂量联合环磷酰胺(Cy)的临床反应率最高(64%)，3级以上的CRS和神经毒性发生率为32%和12%[36]。另外两个备受关注的CAR T-BCMA细胞产品分别是来自蓝鸟生物(Bluebird Bio)的bb2121和中国的南京传奇的LCAR-B38M。bb2121的Ⅰ期临床试验结果显示出更高的临床反应率(85%)，CR率为45%，中位PFS为11.8个月。同时bb2121有相对低的不良反应率，3级以上的CRS和神经毒性发生率仅为3%和6%[37]。LCAR-B38M是针对BCMA双表位包含4-1BB共刺激分子的CAR T细胞，2019年最新临床试验结果显示，17例难治MM患者总缓解率为 88.2%，严格完全缓解率(sCR)为76%，3级以上CRS发生率为35%[38]。在CAR T-BCMA的临床试验治疗中，CRS发生程度与骨髓瘤细胞表面BCMA丰度有相关性，CAR T-BCMA扩增能力与治疗预后相关，之前接受过HSCT的患者具有更持久的临床应答反应。除了单独靶向BCMA之外，2019年徐州医学院附属医院报道了同时输注CAR T-19和CAR T-BCMA治疗21例MM患者的临床试验。结果显示出超高的临床缓解率(95%)，治疗CR率为43%[39]。双重靶点的CAR T细胞组合可能是复发或难治性MM另一个有前途的治疗选择。鉴于针对MM的CAR T细胞治疗临床试验的快速推进，BCMA应该是继CD19之后第二个获得批准上市应用的CAR T细胞产品的靶点。除了BCMA靶点外，包括靶向NY-ESO-1、Kappa轻链、CD44亚型变异体6(CD44v6)、CD56、CD38和CD138 的CAR T细胞治疗MM的基础研究和临床试验也在同步进行，但相对于BCMA靶点，抗上述靶点的CAR T细胞治疗临床MM患者病例较少，尚不能确定临床治疗效果[40]。

4 慢性淋巴细胞白血病

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是常见的B细胞慢性淋巴细胞增生性疾病，主要影响老年人。虽然CLL的5年生存率是79.2%，但在许多患者中CLL仍然是无法治愈的疾病，尤其是难治复发性CLL预后非常差[41]。CLL是最早应用CAR T-19治疗的疾病之一[42]，但应用经验远不如ALL和B-NHL广泛。从2011年首例应用CAR T-19治疗CLL的患者开始，截至2018年6月份，全球不同研究中心大概报道了总计134例CLL患者接受CAR T-19治疗[43]，尽管与ALL治疗中类似的CAR T-19细胞，治疗结果却令人失望。临床反应率约有50%～70%，但CR率只有20%～30%，远远低于同类CAR T-19治疗ALL和B-NHL的临床治疗结果[42]。对于HSCT后的复发CLL患者，供者来源的CAR T-19治疗效果优于自体CAR T-19，且未见GVHD发生的报道[3,44]。CAR T-19治疗CLL的不良反应与其他血液恶性肿瘤不良反应类似，由于每个报道患者数量均未超过30例，因此很难有准确的定位。CRS发生率为50%～100%，>3级的CRS发生率为25%～60%；神经毒性不常见(0～35%)，且少见3级以上神经毒性的报道。目前研究显示CLL对CAR T细胞治疗反应较低的原因多归结于CLL患者固有的免疫导致T细胞表面耗竭指标(包括PD-1、CD244和CD160)异常增高、缺乏记忆细胞以及CD8阳性T细胞增殖能力弱和细胞毒性能力低[45,46]。针对CLL固有免疫存在的特征，有研究机构采用CAR T联合BTK抑制剂-伊鲁替尼进行CLL的治疗，虽然病例较少，但整体缓解反应率超过80%。虽然伊鲁替尼对CLL免疫系统的影响尚不明确，但有研究表明依鲁替尼具有促进CAR T细胞的扩增，维持和促进细胞毒作用[47]。除了CD19靶点外，靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR1)的CAR T治疗CLL的临床试验在进行中。虽然CAR T在CLL治疗中结果并不理想，但针对CAR T治疗后获得CR的CLL患者却表现出非常好的预后，且复发率低，因此CLL患者的CAR T细胞疗法主要挑战是提高反应率和CR率。

5 T细胞恶性肿瘤 (T-cell malignancies)

虽然T细胞恶性肿瘤的总体预后因疾病类型而异，但与B细胞恶性肿瘤相比，通常要差得多。虽然CAR T在B细胞恶性肿瘤中取得了突破性进展，但对于T细胞恶性肿瘤存在很多障碍。对T细胞进行基因工程编辑以杀死恶性T细胞，而保留正常的T细胞过程更为复杂和具有挑战性[48]：①从患者体内分离出完全纯净的正常T细胞用于制备CAR T细胞是技术难题。有文献已经报道单个白血病母细胞在CAR T制备的同时意外被修饰，回输给患者导致白血病复发死亡的临床案例[49]。而对于T细胞恶性肿瘤患者采用自体CAR T疗法所面临的肿瘤细胞被修饰的风险极高。②T细胞肿瘤缺乏特异的肿瘤抗原。大多数T细胞恶性肿瘤表达的CD5、CD7或者CD3等，均是正常T细胞抗原。虽然在B细胞肿瘤的CAR T治疗的不良反应中，正常B细胞会同时被清除，但B细胞缺乏不是致命的，可以通过补充丙种球蛋白弥补。但T细胞缺乏对于人类来说是致命的，因此目前只有少数在正常T细胞上表达受限的抗原被评估为治疗T细胞恶性肿瘤的CAR靶点。包括CD30、CD37、CD1a和TRBC1[50-53]。但是，这些抗原仅在一小部分T细胞恶性肿瘤中表达，不能被广泛应用。③存在“自相残杀”[53]。由于CAR T细胞靶向的抗原均在正常T细胞表面表达，因此在制备过程中，会发生严重的自相残杀而导致CAR T细胞制备数量严重不足。

针对这些障碍，目前针对T细胞恶性肿瘤大部分在临床前研究。通过采用Casper技术敲除T细胞表面靶向抗原避免“自相残杀”[54]；采用NK细胞或者γδT细胞来源制备CAR细胞来降低“自相残杀”和肿瘤T细胞污染的风险；为了降低T细胞长期缺乏带来的致命性风险，采用瞬时基因修饰技术或者安装自杀基因等方式避免CAR T在体内形成记忆性而造成对正常T细胞持久杀伤[48]。

6 其他血液恶性肿瘤

急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)如同T细胞恶性肿瘤一样，CAR T细胞治疗在AML中也同样缺乏特异的肿瘤抗原。目前已知的AML细胞膜上表达的肿瘤抗原在很多正常髓系细胞表面也表达，如CD33在成熟的中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达，CD123在淋巴样祖细胞上表达。动物模型已经证实采用CAR T细胞靶向CD33或CD123治疗，AML细胞被清除的同时正常造血系统也被根除[55,56]。2014年全球首例靶向CD33的CAR T细胞治疗在中国解放军总医院开展，1例AML患者经过CAR T-33治疗后获得了短暂的AML细胞清除，但同时合并重度骨髓抑制[57]。美国希望之城(City Hope)研究小组将活性降低的CAR T-123用于治疗AML的临床试验，但同样只有少数患者获得了短期缓解，CAR T细胞活性降低似乎不能带来有价值的治疗效果。此外有研究机构尝试应用mRNA电穿孔技术制备CAR T-123细胞，以消除CAR T细胞在体内长期存在而带来的对造血系统长期的不良反应；或者在CAR T-123细胞治疗后进行HSCT联合治疗；以及在CAR T-123载体中添加EGFR分子，细胞治疗期间可以应用抗EGFR抗体消除体内的CAR T-123细胞来降低对正常造血系统的毒性[58,59]。今后CAR T细胞针对AML的治疗更倾向于清除肿瘤细胞和维持正常造血系统的平衡，在安全性基础上提高长期缓解率。

霍奇金淋巴瘤(HL)/间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)：经典HL和ALCL缺乏CD19的表达，针对这两种肿瘤，中国解放军总医院和美国贝勒医学院分别用靶向CD30的CAR T开展临床试验研究[50,60]。两家机构在CAR T-30设计上包括scFv、共刺激信号、临床方案和剂量均不同，但都表明了CAR T-30针对HL和ALCL有一定的抗肿瘤作用，不良反应发生率较低，多集中在1～2级。尽管两项研究均显示出良好的耐受性和部分肿瘤抑制效果，但与CAR T-19治疗效果相比还相差较远。目前仍有几项不同载体设计的CAR T-30针对复发/难治性淋巴瘤中的临床试验在进行，期望通过CAR结构设计和临床联合方案提高对HL/ALCL的治疗效果。

7 展望

虽然CAR T细胞疗法正在成为治疗血液恶行肿瘤一个有力的治疗手段，但对于CAR T治疗肿瘤其实刚刚开始，许多重要的生物学问题仍有待解决。包括优化CAR信号，确定最佳的肿瘤特异抗原，优化CAR T细胞的制造方法，提高CAR T细胞疗法的安全性，最佳组合的选择策略，以提高改善CAR T细胞的治疗潜力，扩大更多有效的治疗肿瘤类型。解决CAR T治疗后的复发、先天性抵抗以及肿瘤微环境、耗竭等各种问题，将势在必行。遗传修饰能满足提高CAR T本身效能不足或者降低耗竭，以及改进归巢至肿瘤及维持体内持久性，可以设想作为将来在CAR T研究的一个方向。