T细胞受体库在常见肿瘤免疫治疗中的研究进展①

王娟娟 张 锴 刘 莉 (华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心,武汉 430023)

作为适应性免疫的关键细胞效应器，T细胞通过其表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)以识别和消灭肿瘤细胞。TCR由胚系基因于胸腺中进行V(D)J基因重排而形成，胸腺细胞经由复杂的阳性选择和阴性选择有序分化，发育成熟组成具有多样性的T细胞库，一个单独T细胞中TCR的总数被称为一个TCR repertoire或TCR profile。TCR库会随着疾病的发生和发展产生变化。每个TCR链都包含3个高变区，被命名为complementarity-determining region(CDR1-3)，CDR3因其高度多样性被作为决定T细胞克隆类型的区域。近年来测序技术的发展使我们可以更快更准确的评估TCR CDR3的多样性，并评估TCR库的克隆组成，包括TCR库的大小、库之间的相似性、V(D)J段使用、核苷酸插入和缺失、CDR3长度等[1]。研究表明，TCR库在淋巴瘤微小残留病灶的检测、移植免疫治疗后监测、自身免疫疾病的诊断等方面均有价值[2-4]。TCR多样性是适应性免疫应答特异性的基础，对于肿瘤免疫应答分子机制研究意义重大。有研究报道了免疫治疗前后TCR库变化与免疫应答之间的相关性，提示TCR库作为肿瘤免疫治疗潜在生物标志物的可能性[5]。本文将围绕TCR库与常见肿瘤免疫治疗之间的关系展开综述。

1 TCR概述

TCR是由不精确的体细胞基因重组产生的极其多样化的基因编码的异二聚体蛋白质，根据TCR基因，T细胞可分为α/βT细胞和γ/δT细胞。对于人类而言，大多数T细胞是α/βTCR，而γ/δT细胞占总T细胞的0.5%～16%(平均约4%)[6]。TCR的多样性使得受体能够识别各类抗原，从而激发出一种有效的适应性免疫反应[7]。

1.1TCR的检测技术 TCR的检测方法包括常规PCR、克隆以及测序。近年来，测序技术的发展让我们能够更加迅速且准确地获取与TCR有关的海量数据。作为人类打开测序的开端，2001年人类基因组测序使用的Sanger技术是经典的一代测序[8]。通过对编码TCR上可变区的DNA片段进行测序，从而了解TCR的多样性。但测序成本高、通量低等方面的缺点，限制了其应用与推广。高通量测序又称第二代测序或下一代测序[9]，是一种大规模并行测序技术，能一次并行对几十万到几百万甚至几千万DNA分子进行序列测定，降低成本的同时提高测序速度，并保持了高准确性。第三代测序方法即单分子测序，可直接检测单个碱基信号，最大的特点是无需进行PCR扩增，因其成本较高，尚未广泛应用。

1.2TCR的多样性 为了应对多种病原体，T细胞必须能够识别许多不同的非自身肽，因此，T细胞应表达广泛多样的独特TCR。TCR的多样性来源于专门的遗传多样化机制[10]。一方面，在人类中，TCR的基因区段包括TCRβ链的40～48个功能性TRBV、2个TRBD、12～13个TRBJ和2个TRBC基因以及TCRα链的44～46个TRAV、50个TRAJ和1个TRAC基因，多样性通过在TCR基因重排期间组合不同的基因区段来介导。另一方面，重组过程中在V、J和D片段之间的连接点添加P(alindromic)和N(on-template)-核苷酸和/或N-核苷酸缺失可导致连接区突变，多样性也由此突变产生。多基因片段、组合多样性、连接多样性形成了TCR的多样性，从理论上讲，重组机制产生的潜在多样性估计高达1015[11]。

1.3TCR库的异质性 肿瘤异质性是肿瘤治疗的主要障碍之一，与肿瘤耐药性的发生和肿瘤复发均相关。肿瘤异质性不仅存在于肿瘤细胞内，还可能存在于TCR库中。TCR库的差异一方面存在于肿瘤与正常组织或其他肿瘤之间，另一方面存在于同一肿瘤内的不同区域之间。差异表现在TCR库的克隆组成、克隆型、CDR3多样性以及CD8+T细胞的扩增等方面。以结肠癌为例，研究表明结肠肿瘤组织与相邻的健康黏膜组织之间的TCR序列具有显著差异[12]。一项关于卵巢癌的研究表明肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)TCR库的克隆组成在每个卵巢肿瘤中表现出均一性[13]。而在肾细胞癌中，在肿瘤的不同区域TIL TCR库的克隆组成是有差异的[14]。这些相反的结果提示源自不同肿瘤的TCR库的克隆组成表现不同。关于胰腺癌的研究，通过分析TCR CDR3基因序列发现胰腺癌患者与健康对照组之间的TCR无显著差异[15]，各组之间CDR3的类型和长度相似，这种与正常组织之间差异不显著的表现与乳腺癌、肺癌等肿瘤不同。此外，Reuben等[16]的研究对来自11个局灶性肺腺癌的45个肿瘤区域中的TCR进行了测序，观察到肿瘤内T细胞的密度和克隆性存在实质性差异，大多数T细胞克隆均局限于单个肿瘤区域。TCR库中的空间差异可能是由不同肿瘤区域中不同的新抗原驱动。

2 TCR库与常见肿瘤免疫治疗

T细胞受体介导T细胞识别不同的肿瘤抗原肽从而启动抗肿瘤免疫的过程，是肿瘤免疫反应的关键环节[17]。肿瘤免疫治疗包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂(ICB)、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。随着免疫疗法的巨大成功，免疫检查点抑制剂(ICB)疗法获得了极大关注。ICB最初被批准用于恶性黑色素瘤、肺癌，随着近些年来免疫治疗适应症的扩大，针对乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤的免疫治疗研究浮出水面。接下来将重点阐述不同恶性肿瘤的免疫治疗与TCR库之间的相关联系。

2.1恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM) 关于TCR库与肿瘤之间的故事最初从黑色素瘤开始，早在1996年就有研究者分析了基于IFN-α/IL-2的免疫疗法对TCR模式的影响[18]。随后，Robert等[19]关于黑色素瘤患者的免疫治疗研究发现抗CTLA-4的免疫治疗会导致TCR库的扩大，同时发现这种扩大与毒性增加有关。但Robert并未发现应答者和非应答者在抗CTLA-4治疗的基线TCR多样性存在任何差异。随后有研究报道，TCR的多样性与抗CTLA-4免疫治疗后的临床获益具有相关性，这两项研究结果的差异可能是由于使用了不同的CTLA-4检查点阻断剂，即tremelimumab和ipilimumab[20,21]。

已有研究向我们证实了PD-1和CTLA-4抑制对黑素瘤患者外周TCR库的不同影响，二者虽然都能重塑TCR库，但是起作用的方式不同[22,23]。由于PD-1的作用机制，PD-1治疗的TCR库研究主要集中在肿瘤库，而不是外周库。Tumeh等[24]通过比较抗PD-1治疗(pembrolizumab)基线和给药后肿瘤活组织检查的TCR克隆性，发现临床应答者的样本在抗PD-1治疗后具有超过10倍的克隆扩增。然而Kuehm等[25]的最新研究表示免疫检查点抑制剂疗法会增强小鼠肿瘤浸润性T细胞的频率和效应功能，但并不改变TCR多样性。与之前的研究有所矛盾，因此进一步的研究值得我们去探讨。已有研究通过TCR测序对黑色素瘤患者进行分层，将其应用到临床患者中，从而筛选出可能从免疫治疗中获益的患者[26]。免疫治疗与TCR的关系在黑色素瘤中的研究为进一步探索其他瘤种奠定了基础。

2.2非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 最近的一项研究，证明了肺癌患者中存在独特的T细胞免疫微环境。该研究分析了15例肺癌患者的肺癌组织和匹配的远处非肿瘤肺组织(正常肺组织)中的TCR库[27]，发现虽然T细胞克隆的总体分布在癌组织和正常肺组织之间是相似的，但是在克隆比例、TCR多样性等方面有显著差异，且肿瘤中较高的TCR多样性与较差的临床获益显著相关。

NSCLC的特征在于突变的逐步出现，其中某些突变促进了新抗原的产生，使TCR库发生改变。同样的，TCR库也在一定程度上反映肿瘤的突变情况。Miyauchi等[28]研究了EGFR基因与TCR库之间的关系，该研究收集了39对配对的(正常和肿瘤)肺腺癌组织样本(其中20个具有EGFR突变)进行TCR测序分析，结果表明EGFR野生型肿瘤的TCR克隆扩增要比EGFR突变型肿瘤的克隆扩增更大。最近Joshi等[29]通过研究了TCR库异质性与基因组异质性之间的关系，发现TCR库的空间异质性反映了肺癌的突变情况。在肿瘤中选择性扩增的TCR序列的数目在肿瘤内部和瘤体之间变化，与非同义突变的数目相关。此外，TCR库被认为是免疫治疗的潜在预测生物标记物，近期研究表明外周血PD-1+CD8+T细胞中TCR多样性和克隆性可以作为患者对免疫治疗疗效和NSCLC患者生存结果的非侵入性预测指标[30]。

联合治疗对TCR库的影响与治疗方式有关。Wilkins等[31]在NSCLC中发现放疗联合抗CTLA-4治疗可能重塑了TCR库，并且针对新的肿瘤抗原出现了新的克隆型。除了放疗，靶向治疗联合免疫治疗的研究也有报道[32]，该研究发现FGFR抑制剂(erdafitinib)可导致克隆性下降，一方面可能是T细胞群体具有更均衡的克隆频率分布，因而克隆数量更少；另一方面可能是由抗原呈递细胞(APC)暴露于肿瘤抗原库而引发的免疫反应，是治疗直接诱导的肿瘤细胞凋亡的结果。与单独使用erdafitinib的治疗相比，联合治疗使T细胞克隆分数和克隆性均显著增加，这可能与抗PD-1治疗推动了肿瘤特异性T细胞克隆的扩增有关。因此联合治疗可促进T细胞克隆的扩增以及肿瘤微环境中的免疫学变化，以增强抗肿瘤免疫力和增加存活率。

2.3乳腺癌(breast cancer，BC) 在乳腺癌TCR相关研究中，癌组织与癌周组织及腋淋巴结中T细胞的TCR差异在很大程度上尚未被发现。Wang等[33]使用多重PCR和高通量测序分析了乳腺癌患者的肿瘤、邻近非肿瘤组织和腋窝淋巴结中T细胞的TCR组成，研究发现肿瘤中的TCR库多样性低于淋巴结，但高于非肿瘤组织，并且可变基因和连接基因的使用频率较高。该研究还发现阳性淋巴结增强了T细胞向肿瘤的浸润和淋巴结中T细胞克隆的扩增，乳腺癌的分子表型也可以改变组织间T细胞库相似性。关于乳腺癌免疫治疗与TCR关系的研究也越来越多。最近一项关于双重检查点抑制剂的互补机制研究发现免疫治疗可以扩展独特的TCR库[34]，分析显示TCR库在抗CTLA-4治疗后显著变化，但未因添加抗PD-1治疗而改变。具体原因有待我们继续探讨。在临床上，免疫治疗不仅可以单独发挥作用，也可以联合其他治疗，例如放疗、靶向治疗或其他免疫疗法，共同发挥抗肿瘤作用。Rudqvist等[35]发现乳腺癌的联合治疗后，不仅CD8/CD4的比率显著增加，CD8+T 细胞的克隆扩增也较为显著，而且出现了新的克隆型，CDR3的长度也明显增加。

2.4其他肿瘤 Sheikh等[36]使用TCRVβCDR3序列的NGS来鉴定接受sipuleucel-T治疗的早期前列腺癌患者肿瘤组织及外周血中T细胞亚群的变化，确定了用sipuleucel-T治疗的患者中外周血与肿瘤组织TCR特征有更高的关联性。这些发现表明sipuleucel-T可能通过增加抗原特异性免疫库来调节肿瘤相关免疫反应，从而减少外周循环中T细胞的多样性。相关的研究也在结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌等不同肿瘤中开展[37-39]。这些研究或多或少都证明了TCR库与肿瘤治疗之间密切的联系，为后续研究TCR作为生物标志物的可行性提供了支持。

3 结语

随着测序技术的发展，TCR的相关分析不仅变得更容易，而且更准确[40]。免疫治疗在不同的环境下以不同的方式重塑了TCR库，同样地，TCR库也在一定程度上反映了体内免疫应答状态，可作为肿瘤免疫治疗的潜在生物标志物。但其在更广泛的研究和临床应用中仍面临挑战，首先是获益人群及治疗领域的局限性，如何使更多的患者在免疫治疗中获益，如何应对免疫相关不良反应，如何扩大免疫治疗适应症等这些问题仍需继续探究。其次，虽然TCR库的测序分析能够监测肿瘤内和外周血T细胞的存在以及数量和克隆扩增情况。然而，仅通过这一信息尚不足以完全反映适应性免疫应答，仍需要更大规模的研究来确认TCR库作为预测标志物的可行性及稳定性。