动物深静脉血栓形成前后的实验性研究进展

朱 聪,毕 衡

(1.云南中医药大学,云南 昆明650000;2.云南省中医医院,云南 昆明650000)

深静脉血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)是血液在深静脉内异常凝结为血栓引起的静脉回流障碍性疾病。若血栓脱落则可引起肺动脉栓塞(pulmonary embolism,PE),DVT与PE统称为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE),是同种疾病在不同阶段的表现,多见于近期有严重创伤或大手术后、肢体制动或肿瘤患者[1]。影响DVT的三大因素为静脉壁损伤、静脉血流滞缓和血液高凝状态[2]。由于医学伦理的关系,该项研究仅在实验动物中开展,因此国内外学者利用兔、犬、大鼠、小鼠等实验动物制备具有针对性的DVT模型,虽然其研究各有侧重,但都未曾脱离对上述DVT因素的基础研究。本文对近年来关于DVT动物实验性研究进行综述,以便为临床科研工作者提供参考。

1 静脉壁损伤的研究进展

静脉壁由外膜、中层和内膜组成。当内膜损伤时,内皮细胞缺损、脱落,此时机体局部血细胞聚集、血小板黏附,最终形成血栓。通过了解DVT与内皮细胞损伤的相互关系,建立相对应的静脉内膜损伤后血栓动物模型,以此研究针对内皮细胞的辅助药物,并分析其特异性代谢方式,是目前静脉壁损伤的主要研究模式。

王兵等[3]将120只新西兰大白兔随机分为创伤固定组、骨折固定组、单纯固定组及空白对照组,光学显微镜下观察不同时相点白兔股静脉血栓形成及静脉壁损伤情况,结果显示,第7日创伤固定组血栓发生率为80%,伴有静脉内膜损伤、内皮细胞剥脱,发现白兔创伤性DVT与静脉内膜内皮细胞损伤密切相关。司春强[4]将55只家兔随机分为正常组5只,血栓组、假手术组各25只,于实验后半日及1、2、4、7 d取实验段血管,采用透射电子显微镜观察内皮细胞凋亡情况,发现在家兔急性DVT后的1～2 d内,内皮细胞凋亡达到峰值,然后呈下降趋势,借此反向证实DVT与静脉壁的关系。范春芝等[5]在此基础上,选取24只雄性比格犬,以比格犬左下肢股静脉为对照侧,右下肢股静脉为实验侧,采用二维超声心动图测量静脉管腔直径与彩色多普勒超声定位相结合,在超声引导下,通过毛刷破坏静脉内膜的方式成功构建了比格犬下肢DVT的实验模型,该法操作简易、创伤低、血栓形成率较高。在动物模型飞速发展的背景下,王护国等[6]将96只大鼠制备成急性DVT模型后,按血栓形成的阶段分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期,每期再均分为小剂量组[尿激酶2万U/(kg·d)]、中剂量组[尿激酶4万 U/(kg·d)]、大剂量组[尿激酶8万U/(kg·d)]和模型组,实验中连续7 d每日于大鼠尾静脉注射尿激酶,通过HE、苦味酸-天狼猩红染色观察各组血管内皮细胞数量和胶原含量的改变,发现在血栓形成14 d内,尿激酶保护受累血管的内皮细胞而抑制胶原增生,在血栓形成14 d后,尿激酶对受累血管的内皮细胞无保护而对胶原增生仍有抑制作用,这给DVT的治疗提供了有效的参考依据。有学者证明了DVT的代谢失调主要集中在能量代谢、鞘脂和腺苷代谢[7],说明小鼠实验模型中DVT特异性代谢产物的特征,为针对静脉壁的DVT提供了新的研究方向。

2 静脉血流滞缓的研究进展

血流是针对血管内血液的流动而言,其动力是心脏搏动时所产生的压力,当血流量受到血管系统的阻力、血液量等各种因素的影响,均可导致血流缓滞,进而导致血栓的形成。针对静脉血流淤滞这一特征,研究人员通过对血流动力学的研究并分析其变化的影响因素,建立了新的动物DVT模型。

SHIFRI E C等[8]最早提出了DVT中缓慢与急性股静脉阻塞的血流动力学理念,实验中通过使用一个缓慢和渐进的股静脉阻塞模型,发现DVT存在血流动力学作为基础的可能性。为了进一步研究并观测血流变化,韩力群等[9]建立了犬DVT的动物模型,并用彩色多普勒超声连续动态监测血栓形成早期的超声动态声像图及血流动力学变化,发现通过超声动态声像图对犬DVT形成进行动态观察,有助于观察DVT的全过程,特别是对DVT早期的声像图特点的认识。张朝顺等[10]将144只大鼠随机分为S(假手术)组、N(正常对照)组、V1(不完全阻滞左股静脉血流)组、V2(V1＋左下肢制动)组、V3(V1＋注入10%高渗盐水1 m L)组、V4(V1＋注入凝血酶0.25 U)组,每组24只,通过比较各组血栓形成情况,分析病理学方面的差异,并通过病理检查监测血栓不同时期的变化及血管再通情况,结果发现通过V3组的方法,可以建立符合临床研究的DVT大鼠模型,这为DVT的病理转归及防治研究提供了新的可能。

3 血液高凝状态的研究进展

血液由血浆和血细胞构成,血细胞中血小板在体内主要发挥止血功能,对胶原纤维有着较强的亲和力。当内膜损伤后,血小板迅速黏附聚集于损伤部位,同时释放凝血因子,使血液呈现高凝状态,为血栓形成提供了可能。因此,可通过对多种DVT模型的血栓观察,制定出具有针对性的血栓参考指标,并对其血栓弹性进行分析。

白云城等[11]采用狭窄法,将48只雌性大鼠制备成下腔静脉血栓模型,研究发现造模后2 h有血栓开始形成,为典型的红白、白色两种血栓形态,其中红色血栓以红细胞为主,位于远心端,白色血栓以血小板和纤维素为主,位于近心端,形成了对血栓形态的初步认知。吴鹏等[12]用结扎法,将30只大鼠下腔静脉及其分支阻断,并用微血管夹损伤静脉壁以诱导DVT,于手术前第1日和手术后第1、4、7、10、14、21日采静脉血检测,研究发现纤维蛋白原、D-二聚体及凝血酶原时间可作为血栓形成的重要参考指标。YU F T H等[13]选用12只新西兰大白兔随机分为高聚集组和对照组,观察左、右股静脉腔内面积缩小后的急性反应及内皮损伤情况,每组其他5只仅在左股静脉上接受血管狭窄和内皮损伤,对侧右股静脉作为聚集测量的配对对照,通过以上实验发现,红细胞聚集的显著增加促进了大白兔股静脉血栓形成,证实了局部血流动力学改变在DVT发病中的病理生理作用。刘晓娜等[14]采用单侧静脉狭窄法,将15只日本大耳白兔制备成下腔静脉血栓模型,分别于血栓形成后第5、14日,在超声剪切波弹性成像技术辅助下,检测下腔静脉血栓头(近心端)、体、尾(远心端)部的杨氏模量值,并于测量后处死大耳白兔,再将完整的下腔静脉血栓取出,并制备成病理切片观察,发现超声剪切波成像技术下血栓弹性存在明显异质性,这对于DVT下血栓弹性的研究提供了新的认知空间。

4 小结

1970年,就有学者将创伤研究的模型分为人体、人类学、活体动物和非物理模型4类[15],而活体动物模型在当今医学界应用最广,与此同时,由于理想的动物血栓模型并不存在,动物不会自发性的出现静脉血栓症[16],因此在DVT实验中就选择了与人类基因较为密切的活体动物如兔、大鼠、小鼠等,作为研究对象。虽然均存在大小、结构等的差异,但因其廉价、身体新陈代谢快,手术操作性强,能够满足学者模拟相关临床环境的需求,被用于造模等。

近年来,高龄、肥胖、静脉曲张、重度吸烟等人群明显增多,成为静脉血栓症形成的高危因素,这些危险因素相互叠加、相互影响,以致在近期有大手术或严重创伤后、长期卧床、肢体制动等可能引起血流滞缓的情况下,导致血管内皮缺氧、血液高凝、氧化应激,从而促使DVT的发生[17]。因此,DVT的三大因素并不是独立存在的,通常有着连锁效应,具有针对性的损伤造模尤为重要。目前国内见诸报道的造模方式主要有结扎法[12]、狭窄法[11,14]、氯化铁法[18]、血栓诱导剂干预法[9]等,都能建立可靠有效的DVT动物模型,同时测量血栓的重量、大小及组织学评估、影像技术的发展(如CT、核磁共振、高频超声)为动物模型的血栓测定提供了更加全面多样的选择途径[19]。近年来也有学者提出新的血栓形成三要素:血管壁内皮细胞的活化、血小板黏附聚集和血浆中可溶性凝血因子的激活[20];通过无创操作检测D-二聚体浓度与创伤患者的深静脉血栓形成的相关性,具有一定的预测诊断价值[21];通过转基因技术深入DVT模型的制备,研究其发病机制也是重要的研究途径[22]。随着动物实验选材的多样性,动物研究能够从宏观到微观、从病因到病程、从治疗到诊断,充分体现着制备DVT动物模型的重要性,也为临床进行早期干预治疗提供最佳时机、减少并发症、改善患者预后提供了重要参考。