QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱测定婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂

杨明，伊鋆，胡筱静，董秋花，许晴，李首道，卢跃鹏，江小明，涂凤琴

（武汉食品化妆品检验所武汉430012）

0 引言

β-受体激动剂属于肾上腺类合成药物，它具有苯乙醇胺结构[1-2]，对支气管哮喘、痉挛和高血压等症状均有较好的效果。其能够扩张平滑肌，进而提高肺活量，同时也可以调控胰岛素从而加速分解体内糖类和脂类。然而在动物饲料中添加此类药物，可以明显提升动物的廋肉率。但是食品中残留的瘦肉精会对人体造成严重的危害，会出现中毒、引发恶性肿瘤，甚至是导致死亡等[3-4]。在2002年，我国已将β-受体激动剂列入《食用动物禁用兽药及其他化合物清单》[5]，然而在经济利益的驱使下，依然存在β-受体激动剂非法滥用的情况。婴幼儿配方奶粉是婴幼儿生长期不可或缺的营养食品，其β-受体激动剂残留将会给婴幼儿的正常发育和健康成长带来巨大的伤害。因此，建立婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂分析方法对于监控婴幼儿配方奶粉中β-受体激动剂残留情况，以保障婴幼儿食品安全具有重要的现实意义。

目前动物源食品中β-受体激动剂类药物的测定方法主要有毛细管电泳法[6]、酶联免疫吸附法（ELISA）[7]、液相色谱法(HPLC)[8]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[9]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[10]等。毛细管电泳法操作简便，但分离能力较弱，稳定性差，重现性不好。酶联免疫吸附法快速简单，但易出现假阳性。GC-MS法通常需要衍生化处理，操作繁琐。HPLC法分离效果较好，但是定性能力和特异性较差；HPLC法定性能力较弱，特异性较差；HPLC-MS/MS法具有高灵敏度、高选择性和抗干扰能力强等特点，已在动物源类食品分析中得到广泛的应用。在前处理技术方面，传统的前处理技术存在有机溶剂使用量大、操作复杂等缺点。QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe）技术其具有操作简单、便捷高效、溶剂用量小等特点，近年来在兽药残留检测领域应用广泛[11-12]。目前关于婴幼儿配方奶粉中β-受体激动剂测定的方法少见报道。本研究结合了QuECh-ERS技术的操作快速简便和质谱的高选择性、高灵敏度等特点，建立了QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱（QuEChERS-HPLC-MS/MS）同时检测婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂类药物残留的分析方法。方法操作简便、分析速度快、准确性高、重现性好，能够为婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂残留状况的监测提供有力的技术支撑。

1 实验

1.1 仪器与试剂

SCIEX4500TripleQuad质谱仪(配有可用于电喷雾电离的TurboV离子源），美国ABSCIEX公司；LC30A液相色谱仪，日本岛津公司；AllegraX-15R Centrifuge离心机，美国贝克曼库尔特公司；Vortex-Genie2涡旋振荡器，美国ScientificIndustries公司；PM5-2000TL超声波清洗器，普律玛仪器公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；ME204/02电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；旋转蒸发仪，英国Genevac公司。

克伦特罗（CAS：37148-27-9）、沙丁胺醇（CAS：18559-94-9）、莱克多巴胺（CAS：90274-24-1）、特布特林（CAS：23031-32-5）、西马特罗（CAS：54239-37-1）、喷 布 特 罗（CAS：38363-32-5）、妥 布 特 罗（CAS：41570-61-0）、马布特罗（CAS：54240-36-7）、马喷特罗（CAS：95656-68-1）、溴氯布特罗（CAS：37153-52-9）、溴布特罗（CAS：41937-02-4）、羟甲基克伦特罗（CAS：

37162-89-3）、塞布特罗（CAS：54239-37-1）、盐酸苯氧丙酚胺（CAS：579-56-6）均为FirstStandard品牌标准品（纯度均≥97.0%），天津阿尔塔科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙酸铵（均为色谱纯），德国Merck公司；甲酸、氨水（均为色谱纯），美国Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、氨基（NH2）吸附剂、中性氧化铝(Al2O3-N)、弗罗里硅土（Florisil）和氧化锆（Zirconia），上海安谱科学仪器公司；乙酸铵、氯化钠（NaCl）、硫酸镁（MgSO4）和硫酸钠（Na2SO4），国药集团化学试剂有限公司；超纯水（18.2MΩ·cm）由Milli-Q超纯水系统制得。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取适量14种β-受体激动剂标准品，用甲醇溶解，配制质量浓度约为10μg/mL的标准储备液，于-18°C保存。临用时用空白样品基质提取液配制系列浓度的标准工作溶液，用于制作标准曲线。

1.3 样品前处理

婴幼儿配方奶粉充分混匀，准确称取1g（精确至0.0001）试样置于50mL具塞塑料离心管中，加入5.0mL2mol/L乙酸铵缓冲液，50μLβ-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶，涡旋使奶粉充分溶解，37℃酶解12h，然后再加入10mL5.0%氨水乙腈，涡旋混匀，超声提取30min，加入3gNaCl+3gNa2SO4，涡旋振荡,以4750r/min冷冻离心5min。取全部上清液置于含100mgPSA吸附剂的15mL具塞离心管中，涡旋振荡2min，4750r/min离心5min，取5mL上清液于试管中，40℃旋转浓缩至近干，用1.0mL乙腈-0.1%甲酸水（1+9，体积比）复溶，经0.22μm滤膜过滤后，供HPLC-MS/MS测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm)；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相A：5mmol/L乙酸铵/0.1%甲酸水；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5min，5.0%B；1.5～4.0min，5.0%～40.0%B；4.0～6.0min，40.0%～90.0%B；6.0～9.0min，90.0%B；9.0～9.01min，90.0%～5.0%B；9.01～12.0min，5.0%B。

1.4.2 质谱条件

电离源：ESI正离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压(IS)：4500V；雾化气(GS1)：50.0psi；辅助气流速(GS2)：50psi；气帘气压力(CUR)：35psi；碰撞气体(CAD)：Medium；离子源温度(TEM)：500℃。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

利用针泵进样将两种目标化合物的标准溶液注入质谱仪中优化质谱参数。分别采用ESI+和ESI-模式对14种β-受体激动剂进行母离子全扫描，结果表明14种β-受体激动剂在ESI+和ESI-模式下均有较高的质谱响应，在ESI+模式下信号稳定性较好。因此优先选择ESI+扫描模式，在该模式下两种化合物均产生[M+H]+的母离子。对两种化合物进行二级碎片离子扫描，选择响应较高、干扰小的两个碎片离子用于定性定量分析，其中响应最高的碎片离子用于定量分析，同时优化各目标化合物的去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等质谱参数。目标化合物的质谱条件如表1所示。

2.2 色谱条件的优化

本实验选择WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm)色谱柱对14种β-受体激动剂进行分离分析。采用ESI+模式，比较了14种β-受体激动剂在乙腈-水与甲醇-水流动相体系中的色谱行为，结果表明，目标化合物在乙腈-水流动相体系中分离度较好。在流动相中加入适量的酸和乙酸铵可以提高分析物的离子响应和分离度，从而达到足够的灵敏度。因此，本研究进一步考察在流动相体系中添加不同含量的甲酸、乙酸铵对目标物响应的影响。结果表明，以5 mmol/L乙酸铵/0.1%甲酸水-乙腈为流动相时，各目标物的质谱响应高、保留稳定且峰形好。因此，本实验采用5 mmol/L乙酸铵/0.1%甲酸水-乙腈作为流动相。

表1 14种β-受体激动剂的母离子、子离子等重要质谱参数

2.3 提取试剂优化

14种化合物具有苯乙醇胺结构母核[13]，极性强，易溶于乙腈、甲醇和乙酸乙酯等溶剂，本实验选用乙腈、甲醇和乙酸乙酯作为提取溶剂并比较其提取效率。结果发现，甲醇提取液的水分较多且颜色较深，不仅会干扰目标物的分析、损害色谱柱、污染质谱离子源；乙酸乙酯作为提取溶剂时乳化现象严重；婴幼儿配方奶粉中含有丰富的蛋白质和脂类，而乙腈具有很好的沉淀蛋白作用[14]，且各化合物的提取回收率均优于甲醇和乙酸乙酯。故本实验选择乙腈作为提取溶剂，同时进一步考察比较了添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和6%氨水的乙腈提取情况，测定结果以3次平行测定的平均值表示。结果表明：14种目标化合物在0.5%、1%、2%三种氨水乙腈提取溶剂中平均回收率相差不大，分别为72.61%、72.14%、71.66%，且略低于3%、4%、6%三种氨水乙腈的平均回收率，分别为77.06%、81.06%、79.87%。相比之下5%氨水乙腈作为提取溶剂时的平均回收率最高，为93.30%，特别是沙丁胺醇的回收率大大高于其它5种，且各目标物的回收率均在80%～110%之间，完全满足实验要求。因此本实验采用5%氨水乙腈作为提取溶剂。不同提取溶剂对目标物回收率的影响如图1所示。

图1 不同提取溶剂对目标物回收率的影响

2.4 吸附剂的选择

婴幼儿配方奶粉基质中富含蛋白质、脂肪和糖类等多种有机成分，可能会对目标化合物的测定造成干扰。本实验考察了含量均为100 mg的PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、NH2吸附剂、中性氧化铝（Al2O3-N）和弗罗里硅土（Florisil）和氧化锆（Zirconia）等QuECh-ERS方法常用净化剂对目标化合物的净化效果和回收率情况，测定结果以3次平行测定的平均值表示。结果表明（如图2所示），NH2吸附剂和Al2O3-N作为吸附剂时各目标化合物的平均回收率分别为79.81%和76.61%，均在70%～80%之间；PSA、C18、GCB、Florisil和Zirconia作为吸附剂时各目标化合物平均回收率分别为83.45%、84.72%、85.84%、83.88%和80.35%，均优于NH2吸附剂和Al2O3-N，且喷布特罗在PSA吸附剂条件下的回收率为70.93%，而在其它6种吸附剂条件下回收率均低于60%，表明这六种吸附剂对喷布特罗具有一定程度的吸附。故本实验最终选用100 mg PSA吸附剂对样品提取液进行净化。

图2 不同净化剂对目标物回收率的影响

2.5 盐析剂的优化

NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的盐析剂，婴幼儿配方奶粉样品经过酶解后的水分含量较高，需要加入合适的盐析剂使在用5%氨水乙腈提取时出现有机相和水相分层，以达到除水的目的。本实验考察了6 g NaCl、6 g MgSO4、6 g Na2SO4、3 g NaCl+3 g MgSO4、3 g NaCl+3 g Na2SO4、3 g MgSO4+3 g Na2SO46种盐析剂对目标化合物回收率的影响，测定结果以3次平行测定的平均值表示。结果表明（如图3所示），Mg-SO4、NaCl+MgSO4、MgSO4+Na2SO4三种盐析剂分别为52.71%、78.71%、60.85%，各目标化合物平均回收率偏低，可能原因是目标物与Mg2+发生螯合反应；Na2SO4作为盐析剂时目标化合物的平均回收率为53.14%，完全不满足实验要求；而NaCl和NaCl+Na2SO4这两种作为盐析剂时平均回收率分别为83.29%和90.59%，很明显NaCl+Na2SO4作为盐析剂时效果优于NaCl。因此，在该实验中，选择3 g NaCl+3 g Na2SO4作为盐析剂。

图3 不同盐析剂对目标物回收率的影响

2.6 基质效应

基质效应（Matrix Effect,ME）是指目标化合物在离子化时受到样品基质中的某些组分的干扰而引起的分析信号变化，包括基质增强效应和基质抑制效应。基质效应可通过比较基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率来评价[15]。计算公式：ME=基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率。当ME为0.85-1.15时，基质效应不明显；当ME＞1.15时，存在基质增强效应；当ME＜0.85时，存在基质抑制效应[16]。本实验对14种β-受体激动剂的基质效应进行了评价。结果表明，羟甲基克伦特罗（ME=0.84）基质效应＜0.85，存在一定的基质抑制效应，其它13种化合物的基质效应均在0.85～1.15之间。为使定量分析结果更加准确可靠，故本实验采用基质匹配标准工作溶液作校准曲线来降低基质效应对测定结果的影响。

2.7 方法学考察

用空白基质提取液配制系列浓度的14种β-受体激动剂混合标准工作溶液，在各优化条件下分析测定，以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)绘制基质标准工作曲线。结果表明，14种目标化合物在0.5～58.0 ng/mL的质量浓度范围内线性关系良好，线性相关系数（r）均大于0.9990。以3倍信噪比（S/N）计算检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N）计算定量限（LOQ），目标化合物的检出限均为0.12～0.52μg/kg，定量限为0.40～1.73μg/kg。选取阴性样品添加3个浓度水平(2.0、10.0、40.0μg/kg)的混合标准溶液，每个加标水平做6个平行样，以考察方法的回收率和精密度。结果见表2，14种目标化合物的平均回收率为70.69%～98.54%，相对标准偏差为0.59%～9.24%，方法回收率高、精密度高，满足婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂残留监测的要求。

表2 分析物的线性范围、线性方程、检出限、定量限、加标回收率和相对标准偏差（n=6）

2.8 实际样品测定

采用本方法对从市场上随机抽取的56批次婴幼儿配方奶粉（28批次Ⅰ段，14批次Ⅱ段，14批次Ⅲ段）进行了测定，结果表明，所测婴幼儿配方奶粉中均未检出这14种β-受体激动剂。

3 结论

本研究以5%氨水乙腈为提取溶剂，采用QuECh-ERS前处理技术，结合高效液相色谱-串联质谱技术，通过优化色谱质谱条件，建立了快速测定婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂的分析方法。方法简单快速、操作简便、灵敏可靠，并成功用于实际样品的测定，可作为婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂的定性定量检测手段，对于婴幼儿配方奶粉中14种β-受体激动剂残留情况的监测具有重要的应用价值。