从血管形成角度探究四物汤改善卵巢功能的机制

周凡茹，谈秀娟，刘霞，李凡，张明敏

(华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030)

卵巢是女性生殖系统中重要的生殖器官，具有独特的内分泌体系。卵巢的功能主要表现在周期性的卵泡募集、优势化、排卵、黄体形成和退化，每个排卵周期都伴随有周期性的血管形成，并且二者都受到激素的精密调节[1]。近来许多研究表明，卵巢血管系统对于卵泡激活、生长和存活以及产生高质量卵母细胞和维持妊娠黄体功能十分重要[2]。

中医传统理论认为女子以血为本，以气为用，以肝为先天，肝藏血。《四诊抉微·切诊·诊足脉》中又提出“盖肝者，东方木也，生物之始，又夫人主血，而肝为血海，此脉不衰，则生生之机，犹可望也。”这表明血为人之本始，之于女子尤为重要。《素问·上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛，齿更发长。二七，而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕……七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”由此可见“脉盛”“脉衰”与“肾气”共同维护女性生理、生殖功能，气血充盈、血脉通畅对于女性的正常生殖功能的维持和发挥十分重要。现代研究显示，源自于血管形成相关的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)，不仅参与了卵巢血管形成，而且与卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞以及卵细胞的发育高度相关，基于此种认识，本文围绕卵巢中的血管形成过程，综述现代研究中血管生成因子在其中的作用机制，结合四物汤的临床作用和药理研究，探讨其改善卵巢功能、调经助孕的可能机制。

1 血管功能及形成

1.1 血管的功能

人体的血管系统由大量的血管组成，这些血管对于血液在整个循环系统的正常运行发挥重要作用，只有通过这种广泛的动脉、毛细血管和静脉网络，细胞才能维持其功能、基本营养素的吸收以及细胞和代谢废物的清除[3]。因此血管新生与成熟有助于许多生理过程，包括伤口愈合和修复、组织炎症反应、生殖循环和眼睛成熟等[4-5]。

1.2 影响血管形成的相关因子

血管形成是一个复杂的过程，需要如整联蛋白、血管生成素、趋化因子、连接分子、氧传感器、内源性抑制剂等众多刺激信号和抑制信号之间进行精细调控[6]。在这些因素中，VEGF、bFGF、ANG和PDGF是参与血管形成的重要因子。血管内皮生长因子(VEGF)是影响血管形成的关键作用因子，通过刺激血管通透性增高、内皮细胞增殖以及血管内皮的迁移和存活而起作用。然而，只有VEGF不足以形成成熟的血管网络。

VEGF和FGF-2是新血管生长激活的主要调节因子，在血管通透性、内皮细胞增殖和募集中起主要作用。FGF-2通过刺激内皮细胞的迁移和增殖来诱导血管生成，并且促进平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖以维持血管稳定[7]。许多研究表明，VEGF和FGF-2具有协同作用能够刺激血管生成。例如，FGF-2可诱导内皮细胞中VEGF及其受体的表达[8]。同时，VEGF又刺激内皮细胞产生FGF-2，进一步刺激细胞增殖和迁移[9]。

血管生成素(ANG)虽不是内皮细胞有丝分裂原，但对血管生成和血管完整性维持发挥重要作用。有研究表明，Ang-1募集内皮支持细胞以促进血管成熟并维持血管完整性，而Ang-2在早期血管生成中松动支持细胞基质，使现有血管结构不稳定，以允许诸如VEGF等的血管生成因子发挥刺激内皮细胞增殖和迁移的作用[6,10]。

涉及血管生成的另一个重要的生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。PDGF家族至少由四个成员组成：PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C和PDGF-D，它们与两种不同的受体结合，称为PDGFR-α和PDGFR-β[11]。PDGF促进周细胞和平滑肌细胞的募集，对于血管成熟和维持稳定十分重要[12]。

此外，缺氧是血管床扩张的重要刺激因素。正常情况下细胞通过氧气的简单扩散进行氧化，但是当组织生长超过氧气扩散阈值时，便会通过缺氧诱导因子激活血管形成。缺氧诱导因子能够上调许多血管生成相关基因，但是对VEGF的诱导最为显著，可以在数分钟内使其上调高达30倍[13]，从而促进血管新生。

血管新生对生物的血液循环和器官组织构建至关重要,受到复杂而精细的调控，需要多种因子相互作用, 维持着一种动态平衡。在女性生殖生理中，卵巢是血管形成比较激烈的地方，周期性的血管形成维持着卵泡的生长发育和排卵，以及黄体功能的正常发挥，从而维持女性正常的月经，为妊娠的建立提供保障。

2 VEGF与卵巢功能

2.1 VEGF概述

VEGF是1989年从牛脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的一种与肝素结合的同源二聚体糖蛋白激素,是血小板生长因子超家族的重要成员之一[14]。在人类中，VEGF家族由几个成员组成:VEGF-A，VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D，VEGF-E和胎盘生长因子(PIGF)。VEGF受体家族主要由3个成员组成:VEGFR1/Fms-like tyrosine kinase-1(Flt-1)，VEGFR2/KDR/Flk-1和VEGFR3/Flt-4[15-16]。血管内皮生长因子及其受体系统参与血管和淋巴管的形成。VEGFR1和VEGFR2在血管内皮细胞显著表达，在其中传递促血管形成的信号。VEGFR2有酪氨酸激酶活性，因此主要的血管形成信号是由VEGFR2产生的。VEGFR3特定表达于淋巴管内皮细胞，产生淋巴管形成的主要信号[17]。VEGF通过与其特定的受体结合启动多条信号通路，目前对两条基本通路进行了深入研究：Ras-MEK-MAPK通路和PI3K-Akt通路[18]。也有研究报道Akt/Girdin信号通路，促进VEGF依赖性的内皮细胞迁移和血管形成[19]。在卵巢组织中VEGF主要由颗粒细胞、膜细胞及黄体细胞合成[20]，并在卵泡血管形成、卵泡内氧化和黄体生成中起重要作用，进而影响卵泡成熟、卵母细胞质量、受精和胚胎发育能力[21]。

2.2 VEGF与卵巢血管形成

2.2.1 VEGF作用的血管形成促进卵泡的生长发育及排卵

卵巢中新血管的发育为卵泡生长和黄体形成提供必需的营养和激素供应[22]。通过对不同阶段的卵泡观察，发现窦卵泡前的卵泡(包括原始卵泡和次级卵泡)没有独立的血管网络[23]，依赖于来自间质血管的氧气和营养物质的扩散维持生长。在生长中的次级卵泡和更大的卵泡中，周围的膜细胞有丰富的血管，而这些血管并不穿过基底膜。在卵泡破裂后、黄体形成过程中，血管形成加速进行，新生的血管逐渐浸润到黄体中[24]。另外的研究显示,无血管的颗粒细胞通过特定的基底膜与卵泡膜层分隔，毛细血管网络在卵泡膜层发育[25]。因此卵泡的生长发育与周围血管数量是一致的，膜细胞层独立的毛细血管网络的形成对于卵泡发育至关重要[26]，但不会穿透基底膜，从而使颗粒层和卵母细胞维持完全无血管的状态直至排卵[27]。

排卵前优势卵泡具有丰富的血管网络，在排卵中发挥重要作用。使用脉冲多普勒技术测量妇女的卵巢血流量提示有优势卵泡的卵巢血流量增加，并且随着卵泡大小的增加峰值流速增加，优势卵泡排卵前的血管化和流速增加[23]。在一项对单卵生物的研究中表明，优势卵泡的选择过程与血管生成密切相关，优势卵泡比其他卵泡具有更密集的毛细血管网，其周围增加的血流量和血管舒张是排卵期卵泡中发生的特征性事件[28]。

此外，卵泡的生长发育是与血管发生相辅相成的。多项研究表明,次级卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞都表达VEGF及其受体，并且VEGF的产生是阶段依赖性的，随着卵泡的增长，卵泡液的VEGF含量增加[29]。VEGF可以通过促进血管新生和增加细胞通透性，从而增加对卵泡生长重要的生长因子的供应，如促性腺激素、类固醇和氧气等[30]。最近的一项研究提出了一个新的概念，即卵丘细胞获取表皮生长因子受体反应性是卵泡血管形成的一个发育标记，类似于在壁颗粒细胞中FSH诱导的LH受体信号的作用[31]。这个研究打开了新的思路，为研究卵泡血管形成的起点提供了突破。

2.2.2 VEGF促进黄体血管形成及功能维持

黄体是少数由另一个器官的残余物形成的内分泌腺体之一，其功能和存活有范围和时间限制。黄体是颗粒细胞、卵泡膜细胞、毛细血管和成纤维细胞快速重塑、生长、分化和死亡的位点。黄体的形成、维持、消退和类固醇生成是哺乳动物繁殖中最重要且受到严密调控的事件之一[32]，而黄体的血管形成对于黄体结构和功能的发挥至关重要[33]。

在排卵期间，分隔卵泡无血管颗粒层和血管化基质层的基底膜分解，毛细血管进入并迅速萌芽，侵入颗粒细胞层并广泛增殖。排卵后，卵泡形成高度血管化的黄体，分泌大量黄体酮以维持子宫妊娠的能力。有研究者将卵巢内的血管重构与快速增长的肿瘤进行比较，发现黄体建立的血管密度和血流量的速率与其他器官相比是最高的[2]。对人类卵巢进行脉冲多普勒的研究表明,黄体具有高流量，低阻力循环，超过85%增加的流量是流向黄体的。相比身体其他组织，黄体具有单位质量最高的血液供应，是肾脏组织的8倍[34]。然而，如果在2周内没有怀孕，黄体消退，将形成无血管残余，成为白体[23]。据报道，白体实际上是非血管性的，然而血管供应仍然可以在这个黄体阶段中及在退化黄体的血管重塑阶段找到，血管生成仍然存在[35]，所以退化黄体中的血管形成的存在及其作用还有待进一步研究。

此外，一些研究表明血管内皮生长因子具有维持黄体期形成的发达的血管网络的功能，因为在血管生成后阶段使用VEGF抑制剂会导致内皮细胞死亡[36]、组织缺氧[37]并上调紧密连接蛋白，从而降低了血管渗透性[38]。

在卵巢中，卵泡发育和血管形成紧密相关,VEGF可以通过促进卵泡及黄体周围的血管形成，调节卵泡发育的微环境，因此，关注VEGF对于卵巢的作用，对于我们临床改善卵巢功能的治疗具有指导意义。

3 血脉理论与四物汤

3.1 血脉理论研究

《素问·上古天真论》曰：“……二七，而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕。六七，三阳脉衰于上，面皆焦，发始白。七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”由此可见脉之“通”“盛”“衰”“虚”贯穿女性的一生，与女性生殖功能的发挥和维持密不可分。古人认为“女子无子,多因经候不调”(《万氏女科》)，故“求子之道,莫先调经”(《丹溪心法》)，而月经的主要成分是血，血液于脉中正常运行，周流不息，方能发挥正常作用。因此，女子调经必先养血，养血之余，亦不忘通脉，脉通而血足，经调则子成。

《灵枢·五音五味》篇提到：“妇人之生，有余于气，不足于血，以其数脱血也”。表明妇人的体质特点是气有余而血不足，从而说明血之充盛对于妇人生理健康的十分重要。中医学认为，血是循行于脉中而富有营养的液态物质，是构成人体和维持人体生命活动的基本物质。《灵枢·邪客》曰：“营气者，泌其津液，注之于脉，化以为血”。因此，血不仅是有营养作用的液态物质，还具有一个重要特征，便是行于脉中。

所以女子血之为病，除了补血养血之外，更应注重活血调血，使脉道通利，血行脉中，通而不滞，才能发挥其正常功用。而中医对于血之通道的经脉、血脉、脉络等的认识至今未有统一明确的界定。清代医家王清任《医林改错》中说“元气既虚，必不能达于血管，血管无气必停留为瘀”，已将脉称为血管。近代的《竹泉生女科集要》则对血脉、脉络、血络等做出了统一解释：“分走于筋骨肌肉关节，而偏乎周身，血管即在其中，自脏腑入三焦，而外达于遍体，枝干交错，络绎不绝，血走管中，随气而动，是为动脉也，固曰脉络，又曰隧道，而统谓之血脉，亦谓之血络”。此处更为直接的将传统的血脉定义归为现代的血管。更重要的是，吴以岭先生系统整理继承几千年来中医学关于血脉与脉络病变的丰富论述和治疗经验，将脉络与经络区分开来，首次提出以研究“脉络—血管系统病”为主的脉络学说，并提出“脉”作为独立的实体脏器具有其自身结构、功能与代谢特征[39]。基于此脉络学说理论认识，我们将传统的血脉功能与现代的血管作用联系起来，以“女子血之不足”“任通脉盛而有子”为理论基础，探究四物汤作为妇科经方的意义和价值。

3.2 四物汤及类方

四物汤，出自唐·蔺道人《仙授理伤续断秘方》，主治跌打损伤、肠肚中瘀血，将其应用于妇科疾病则首见于宋代《太平惠民和剂局方》，四物汤的药物组成是由《金匮要略·妇人妊娠篇》中的芎归胶艾汤去阿胶、艾叶、甘草而成，是中医妇科最常用的调经、种子打底方。

《医方考》有云：“当归入心脾，芍药入肝，熟地入肾，乃川芎者，彻上彻下而行血中之气者也。此四物汤所以为妇人之要。”四物汤基于补血，重在调血，补血而不滞血，行血而不伤血，温而不燥，滋而不腻，为补血调经的基础方，疗效显著，临床应用广泛。四物汤虽有稳定的配伍结构，但在临症时为了辨证施治，常有不同的加减侧重。

四物汤类方对多种证型的妇科血瘀证痛经均有良好疗效，如气滞血瘀型，四物汤加理气止痛药木香、香附、延胡索等组成香附四物汤;寒凝血瘀型，四物汤加温经散寒药肉桂、干姜、小茴香等组成少腹逐瘀汤;瘀热兼夹型，四物汤加清热除湿药黄连、黄芩组成芩连四物汤;血虚血瘀型，四物汤加桃仁、红花组成桃红四物汤[40]。然而不论四物汤如何化裁变化，均是以补血活血、去瘀通脉为核心，虚者补之，寒者温之，热者清之，瘀者行之，从而调节女子“血不足而气有余”的机体状态，被朱丹溪称为“妇人众疾之总司”[41]。

3.3 四物汤现代研究

对现有的中、英文文献资料进行检索，分析出四物汤的主要生物活性成分包括芍药苷、芍药醇、没食子酸、阿魏酸、z-藳本内酯、川芎嗪、洋川芎内酯A和梓醇[42]。既往的许多研究提示四物汤具体的功效主要体现在以下几个方面:1)调节内分泌和补充微量元素；2)促进造血和纠正贫血；3)抗血小板的聚集和抗血栓的形成；4)免疫调节及抗自由基；5)抗辐射、药物损伤及抗突变；6)抑制子宫活动等方面[43-46]。

最新的一些研究表明，四物汤主要生物活性成分之一的川芎嗪在体外和体内通过抗氧化应激特性和抑制细胞凋亡表现出神经保护作用。一些研究人员还证实了川芎嗪通过不受调节的VEGF信号通路对血管生长具有保护作用[47]。此外，另有研究显示四物汤的主要生物活性成分z-藳本内酯可以减弱血管炎症并激活内皮细胞的防御系统从而产生血管保护作用[48]。由此可见，四物汤的多种活性成分对于血管形成和血管稳定发挥重要作用。

近期的一项采用生物医学方法的研究显示,四物汤和四君子汤通过多条途径促进人体生长发育，增加血流量，促进造血功能，维持子宫正常发育，改善痛经和其他与雌激素相关的疾病，这与中医的血与气的作用是一致的。该研究中特别阐述了四物汤具有影响氨基酸和碳水化合物代谢的功能，能够通过影响抑制性突触(GABA能突触)来调节下丘脑垂体肾上腺和性腺轴的功能活动，以刺激雌激素和类固醇激素分泌，从而改善卵巢功能[49]。

卵巢的结构和功能在育龄期呈现周期性变化特点，并且卵巢是对损伤因素极其敏感的器官，如放化疗、缺血缺氧以及氧化应激都可能导致卵巢功能永久性损伤，乃至衰竭[50]。最新的研究显示,四物汤中多种活性成分能够激活芳香化酶影响雌激素水平，并且产生抗氧化作用从而改善可能由卵泡发育不良引起的月经紊乱[51]。Liu等人的研究显示，四物汤对抗过氧化氢诱导的氧化损伤的细胞保护活性可能部分通过Nrf2的激活介导[52]。多个研究显示通过激活Nrf2/HO-1和HIF-1α/VEGF信号传导途径可以上调抗氧化应激活性并促进血管生[53]。并且已有研究表明四物汤可以通过调节Nrf2/HO-1和NO在人脐静脉内皮细胞中发挥血管保护作用[54]。缺氧诱导因子(HIF1α)似乎是刺激类固醇合成急性调节蛋白(StAR)表达的正调节因子，其在部分缺氧下能够增加颗粒细胞的类固醇生成能力[55]。同时HIF-1α是VEGF表达的主要调节因子，参与卵巢的血管生成，并且其定位会在卵巢周期的不同功能阶段发生变化[37]。因此我们可以推测四物汤能够改善卵巢局部含氧微环境，影响血管形成及卵巢激素水平，从而实现对卵巢功能的调节作用。

中医学认为，女子以血为根本，经、孕、产、乳皆以血为基础，妇科疾病的发生主要在于血、气，多与血瘀有关，因此在治疗时主要采用活血化瘀法。四物汤作为“妇科第一方”，以血证立法，补血配活血，动静相伍，补血而不滞血，行血而不伤血，对活血化瘀法的建立及应用具有重要意义。因此，用现代科学方法重新解读四物汤，从血管形成角度深刻认识补血活血理论，并且全方位剖析四物汤的可能作用机制，对于临床治疗妇科疾病将会有更深远的影响。

4 小结

中医药在妇科领域的应用越来越多，经典方剂——四物汤在改善女性卵巢功能、提高生育能力方面已有一定的临床基础，然而其具体的作用靶点和作用通路仍未有精确阐明。笔者通过探究血管形成的过程，血管形成对于卵巢卵泡发育、卵巢微环境调节的意义，卵巢血管形成过程中的重要因子VEGF的生理特性和作用特点，并结合传统医学对于血脉理论的认识和进展，以及女子以血为用的传统理论认为：四物汤可能通过调节卵巢局部微环境、促进卵巢血管形成从而改善女子卵巢功能，最终实现调经助孕的目的。卵巢微环境呈现周期性的动态变化，血管周期性的生长与崩解是其最显著的特征；四物汤具有养血活血的特点，熟地黄与芍药、当归与川芎又呈现动静结合的配伍特色，这既符合卵巢周期性变化的特点，也充分展示了中医气血、阴阳互根互用的理念。因此，深入挖掘并掌握四物汤的药理特性，探究其养血活血的特点在改善卵巢功能中的机制，定会促进以四物汤为基础方的妇科常用方剂的临床应用，给传统医学应用提供新的思路。