犬冠状病毒研究进展

纪海旺，孙晓荣，孙 科

（1.青岛市崂山区王哥庄街道办事处，山东青岛 266105；2.青岛市崂山区农业农村局，山东青岛 266100；3.青岛市崂山区沙子口街道办事处，山东青岛 266102）

2019年12月以来，由新型冠状病毒（SARSCoV-2）引发的新冠肺炎（COVID-19）疫情在全球暴发流行，给人类健康、公共卫生安全、经济发展和社会稳定造成了巨大影响。SARS-CoV-2是继2003年的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS-CoV），2012年的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）后出现的第七个可以导致人类疾病的冠状病毒。COVID-19的暴发流行，再次引起了人们对冠状病毒的关注。目前，在犬群中已经分离获得了属于α冠状病毒属的犬肠炎冠状病毒和属于β冠状病毒属的犬呼吸道冠状病毒。其感染机体后引起的临床症状通常较轻，但易与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒等可引起肠炎或呼吸道疾病的病原体发生混和感染。2020年2月，我国香港报道了COVID-19患者家养的宠物犬感染了SARS-CoV-2，表明SARS-CoV-2也对犬健康构成了威胁。本文从病原学与流行病学、临床症状、诊断和防治措施等角度，对犬冠状病毒进行了综述，以期为犬冠状病毒病的综合防治提供借鉴。

1 病原学与流行病学

犬冠状病毒（canine coronavirus，CCoV）属于巢式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科。目前，感染犬的冠状病毒主要包括犬肠炎冠状病毒和犬呼吸道冠状病毒（canine respiratory coronavirus，CRCoV）。有关CCoV感染的报道首次出现于1971年，德国科学家Binn等从患急性肠炎的军犬中分离获得了病毒（1-71株），纯化的病毒可实验感染幼犬并出现相似的临床症状[1]。此后CCoV在世界范围内多个国家和地区出现，并成为犬的重要肠道病原体。血清学和病原学研究[2]表明：CCoV在犬群中普遍存在，尤其在犬舍和动物收容所更加流行。国内相关研究人员先后报道了警犬、军犬、民用犬的冠状病毒感染[3]。1995年，解放军农牧大学军事兽医研究所从病犬心脏和胃肠道内容物中分离到CCoV[4]。

目前，肠道CCoV引起自然感染的影响因素尚不完全清楚。CCoV是导致犬肠炎的主要原因之一，感染症状从轻度到中度不等，但对幼犬或与其他病原体共感染时症状较重。常见症状包括粪便稀软、腹泻、呕吐、脱水、食欲不振等，偶尔死亡。CCoV和犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）发生共感染时，症状尤为严重，且CCoV也会加重CPV的感染程度[5]。CCoV的自然感染途径为粪-口传播，因此感染犬粪便为主要传染源。在新生犬中，CCoV主要在小肠上皮细胞的绒毛尖端复制，引起裂解性细胞感染。随后，小肠绒毛缩短或脱落，并在感染后18～72 h导致感染犬发生腹泻。局部产生的IgAs可限制CCoV在肠道内的传播并阻止感染的进展，因此感染犬在临床症状消失后，病毒仍可持续存在6个月之久[5]。CCoV感染的主要传染源是发病犬或带毒犬，其粪便、唾液可对饲料、饮水、犬舍等造成污染，健康犬科动物经口由消化道感染病毒[6-7]。CCoV感染一年四季均可发生，但冬季发生率较高。此外，犬的生活环境、饲养密度、断奶、分窝、调运等因素也能诱发感染或发病。

与所有RNA病毒一样，CCoV在复制过程中极易发生突变，产生毒性更强的毒株并引起更严重的肠道疾病。目前除了已知的I型（CCoV-I）和II型（CCoV-II）两个基因型外，还发现了新的重组CCoV变异株。CCoV-I型和CCoV-II型S蛋白的同源性只有54%，而两种基因型共感染情况很常见[8]。CCoV-I与猫冠状病毒（FCoV-I）由同一种病毒进化而来，但CCoV-I在编码S蛋白的基因下游，存在独特的开放阅读框ORF3（长度为624 nt），而FCoV-I中完全不存在该开放性阅读框，CCoV-II和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）基因组中有该阅读框残留[9]。此外，在患有腹泻的犬粪便中还发现了CCoV-II和TGEV的重组毒株，且广泛分布。最早分离的CCoV属于CCoV-II型，根据S蛋白N末端前300个氨基酸区域（NTD），将CCoVII进一步分为两个亚型：CCoV-IIa和CCoV-IIb，分别包括经典CCoV和TGEV样毒株[10]。该分类方法虽没有被正式接受，但在文献中已被广泛应用。CCoV-IIa在犬类中流行最为普遍，且具有与原型CCoV一致的NTD。经典的CCoV-IIa仅限于感染小肠，而新出现的泛嗜性CCoV-IIa可以全身性传播，引起白细胞减少[11]。CCoV-IIb与CCoVIIa在遗传学上不同，其S蛋白与TGEV有类似的NTD，这在几个欧洲国家以及日本均有报道[10]。近年来，鉴于A76样病毒中新发现了一种NTD，有研究者建议将其分为一个新亚型——CCoV-IIc。它是具有CCoV-I样或FCoV-I样NTD的CCoV-II型病毒。这些病毒在美国和瑞典都有报道[12]。

2003年，英国在病犬中分离到一株属于β冠状病毒属的CCoV，其与牛冠状病毒相近，但遗传进化特点又明显不同，为了与属于α冠状病毒属的犬肠炎冠状病毒相区分，将其命名为CRCoV[13]。随后，日本在家养犬上呼吸道中也分离到了CRCoV。流行病学调查和遗传进化分析表明，日本、韩国、意大利、加拿大、美国等国家均存在CRCoV感染[14]。

2019年12月以来，SARS-CoV-2在全球流行。2020年2月，我国香港首次报道犬可感染SARSCoV-2。目前，比利时、美国、中国、法国、西班牙、德国、俄罗斯、荷兰、丹麦等国家已先后报道了犬、猫、圈养狮子和老虎、水貂等多种动物的SARS-CoV-2感染。Thomas等[15]通过荧光定量PCR、血清学、基因组测序、病毒分离等技术研究发现，15只来自我国香港COVID-19患者家庭饲养的宠物犬中，有2只为SARS-CoV-2阳性。首例SARS-CoV-2感染犬为1只17岁的去势雄性博美犬。在整个检疫期间，该犬未出现明显临床症状，鼻拭子检测为SARS-CoV核酸阳性，但肛拭子和粪便样本为阴性，也没有分离到病毒。另外1只SARS-CoV-2感染犬为2.5岁健康状况良好的雄性德国牧羊犬。其主人被确诊为COVID-19患者后对其进行了检测，在口、鼻和肛拭子中均检测到了SARS-CoV-2核酸，同时在口、鼻拭子中分离获得了病毒。该患者家中的另外1只犬则没有感染SARS-CoV-2。两只感染犬体内均检测到了SARSCoV-2抗体，且病毒核酸序列与其主人体内的一致，在整个检疫期间均未出现临床症状。以上数据表明，这是典型的人感染犬的病例。目前尚不清楚感染犬是否可将病毒传染给其他动物，或者再传染给人类。

2 临床症状及病理变化

犬肠道冠状病毒感染潜伏期较短，自然感染病例为1～4 d，实验感染病例通常只有1～2 d。病犬感染3～14 d后可通过粪便排毒。研究表明，自然感染犬的核酸阳性时间可达发病后6个月（PCR检测）。CCoV感染后主要引起犬轻度或中度肠炎，主要表现为精神沉郁、食欲减退、呕吐、嗜睡和腹泻等。腹泻通常可持续数日，粪便呈水样或粥样，颜色呈暗红色、红色或黄绿色，并混有少量血液或黏液，身体出现脱水症状[16-17]。成年犬感染CCoV后通常可自愈，很少出现死亡，但幼犬感染后症状较为严重，甚至出现死亡。目前，CCoV通常与其他病原体，尤其是与CPV等可引起肠炎症状的病原体发生混合感染，导致更严重的临床症状，甚至死亡[18-19]。CCoV轻度感染时，病理变化较轻微，在重症病例中，可发现肠管膨胀，管壁变薄，充满水样、白色或黄绿色粪便。通常，肠系膜淋巴结出现水肿及肿大，并伴有肺多灶性实变以及肝、脾、肾等器官出血变性[20-21]。病例组织学变化通常包括，肠道损伤以及小肠绒毛萎缩和融合，隐窝加深甚至坏死[21]。

虽然CRCoV具有高度传染性，并可从自然感染犬呼吸道中分离到，但感染犬通常仅表现出亚临床或较温和症状，且用分离病毒接种易感犬也不能完全复制出临床症状。自然状态下，CRCoV感染能否引起临床症状，可能与混合感染和宿主易感性密切相关。目前，尚没有直接证据证明，CRCoV是犬呼吸道疾病的主要病原体，但其作为潜在病原体的可能性需要加以重视。

3 实验室诊断

3.1 病原学检测

病毒的分离、培养是国际公认的病原学诊断的“金标准”。此方法特异性好，但因CCoV较难进行细胞培养，导致其敏感度较低。此外，由于操作复杂、所需时间长、需要特定的试验条件等因素，限制了其在临床或基层单位的使用。可用于CCoV分离培养的细胞包括，犬纤维瘤传代细胞（A72细胞）、原代或传代犬肾细胞（MDCK细胞）、胸腺滑膜细胞、猫肾细胞（CRFK细胞）等[22]。病毒分离培养后，需要再结合电镜观察、中和试验、间接免疫荧光（IFA）、RT-PCR、序列测定分析等方法进一步鉴定[23]。范泉水等[24]利用双抗体夹心原理建立了CCoV ELISA检测方法，可在4 h内完成快速诊断。目前，临床上采用的CCoV检测方法主要为免疫胶体金检测试纸条。此方法操作简单，无需特殊仪器设备，适合临床现场快速诊断，但特异性稍差。

3.2 血清学检测

CCoV感染的血清学诊断主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、中和试验等。研究者利用表达的重组蛋白为包被抗原建立了CCoV抗体间接ELISA检测方法，对50份阳性血清和阴性血清的复检准确率为100%[25]。中和试验是测定血清抗体效价的最有效方法，但因其需要病毒和细胞，操作复杂，且所需时间长，较少用于CCoV感染的诊断。

3.3 分子生物学检测

3.3.1 RT-PCR PCR/RT-PCR是目前最常用的核酸检测方法。Takano等[6]利用建立的CCoV RTPCR检测方法，对收集的101份犬肛拭子样本进行检测，发现CCoV-I和CCoV-II的检出率分别为88.9%和7.4%。Wang等[26]根据CDV和CCoV的H和M基因序列设计了两对引物，建立了一步双重PCR（one-step dPCR）方法，发现该方法与传统PCR具有相同的敏感性。

3.3.2 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR） 近年来，qRT-PCR因其敏感性高，且可对目标核酸含量进行实时定量检测等优点，逐渐成为核酸检测的主流方法。王静等[27]根据CCoVS基因保守区域设计特异性引物，建立了CCoV SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，其最低检测限为40～50 copies/μL，灵敏度是常规RT-PCR检测方法的10倍。

3.3.3 纳米PCR（nano RT-PCR） 纳米PCR是应用某些纳米材料结合PCR技术而产生的一种新兴检测方法，可以进一步提高检测的特异性和敏感性[28]。研究者建立了可鉴别CCoV不同基因型的双重纳米RT-PCR检测方法。该方法对CCoV-I和CCoV-II的最低检测限分别为6.47×101、6.91×102copies/μL；进一步研究发现，犬群中CCoV-I和CCoV-II共感染率为8.33%[29]。

4 防治措施

疫苗免疫是预防传染病的最有效措施。当前用于犬冠状病毒病免疫预防的疫苗主要包括灭活疫苗和弱毒疫苗。无论犬只年龄如何，首次免疫后隔3～4周再次进行两剂量免疫，并于每年加强免疫1次。CCoV主要通过粪-口接触传播，因此科学、合理的饲养管理是预防病毒感染的重要一环。犬舍应每天打扫，清除粪便。CCoV对高温、紫外线、甲醛等敏感，可定期对犬舍用1%～10%甲醛溶液或0.1%过氧乙酸溶液进行全面喷洒消毒[23]，对犬类相关用品进行高温消毒。目前，针对CCoV感染尚没有有效的治疗药物，临床治疗主要以支持性护理为主，通过消炎、止吐、止泻补液和平衡体内电解质的方法提高机体抵抗力。

5 结语

进入21世纪以来，冠状病毒引起了包括急性呼吸综合征（SARS）、中东呼吸综合征（MERS）和COVID-19在内的3次大的传染病暴发流行，给人类健康和公共卫生安全构成了严重威胁。CCoV虽然通常只引起轻微的临床症状，但有研究表明一些新的变异毒株也在不断出现。此外，由于犬也可感染SARS-CoV-2，目前尚不清楚感染犬是否可将病毒再传染给其他动物或人类。因此，应加强CCoV感染的综合防治研究，尤其是病原生态学和疫情监测预警。