绝经后骨质疏松症发病机制的表观遗传学研究进展

王维 赵学千 贾育松 李晋玉*

1.北京中医药大学东直门医院骨伤一区，北京 100700

2.北京中医药大学,北京 100029

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)属原发性骨质疏松症(osteoporosis，OP)的一种，一般发生在女性绝经后2年内，被视作一种多因素引起的年龄相关性慢性退行性病变，主要是由于绝经后女性卵巢功能减退，雌激素水平下降,致使由破骨细胞(osteoclast，OC)主导的骨吸收能力强于由成骨细胞(osteoblast，OB)主导的骨形成，造成骨代谢失衡，骨微结构破坏，骨量减少。

表观遗传学是指在DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生可遗传的遗传信息变化,并最终导致可遗传的表型变化,而且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递且具有可逆潜能[1]。表观遗传学的主要研究内容分为对基因转录过程中的调控和对转录后的调控两部分，具体包括DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(histone modification)、染色质重塑 (chromatin remodeling)和非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)调控等，能够产生基因组印记、母性影响、基因沉默、核仁显性、休眠转座子激活等效应[2]。

骨质疏松症是遗传、表观遗传和环境等多个因素共同作用的结果[3]。大量研究[4]证实了表观遗传学参与PMOP的发生发展，并且有学者认为与基础的遗传因素相比，表观遗传起到了更为关键的作用，其通过影响多条信号通路和相关调节蛋白的表达，参与改变各类骨细胞的分化命运。本文将从DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNAs这三个方面综述表观遗传和绝经后骨质疏松症的关系。

1 DNA甲基化对绝经后骨质疏松症的影响机制

DNA甲基化过程是由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,经过DNA甲基转移酶 (DNMTs) 的催化形成5-甲基胞嘧啶,此过程主要发生于基因的胞嘧啶-鸟嘌呤 (CpG) 双核苷酸序列，并且可以通过DNA的复制而遗传。真核细胞内甲基化状态有三种:持续的低甲基化状态、诱导的去甲基化状态和高度甲基化状态。基因启动子区CpG 甲基化是抑制基因表达最常见的表观遗传现象之一。

就围绝经期女性而言，激素水平改变和衰老会影响体内DNA甲基化程度。Sjur等[4]在POMP患者骨活检中，选取显著影响骨密度(bone mineral density，BMD)水平的基因进行甲基化分析，发现CpG甲基化数量最多的前4位转录物(MEPE,SOST,DKK1,WIF1)均为骨代谢抑制因子，认为骨代谢有关基因的CpG甲基化程度与BMD高低以及骨折风险相关。但在PMOP发病过程中，所涉及的基因DNA甲基化趋势的上调或下调，要取决于基因本身及其所在组织。

1.1 雌激素受体的DNA甲基化

雌激素受体(estrogen receptor,ER)广泛存在于各类骨细胞当中，不仅可以通过ER经典基因组效应等途径与雌激素结合发挥作用，还可作为雌激素转录因子发挥更多作用[5]。ER在雌激素介导下对于Wnt/β-catenin、BMP-smads、MAPK等多个成骨分化信号通路都具有调节作用[6-8]。研究[9]发现绝经后妇女体内Erα甲基化程度升高导致ER表达量下降，而ERα高甲基化可能与绝经期妇女血清同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy)升高有关。LV等[9]研究认为Hcy使ERα启动子A区甲基化程度升高从而抑制ERα表达。Hcy自身也可以通过增加OC活性、降低OB活性和直接作用于骨基质等途径参与骨代谢[10]。

1.2 调节因子的DNA甲基化

骨形成蛋白(BMP)是生长转化因子(TGF-β)的一种，其介导的BMP-Smads信号通路参与BMSCs向OB的分化增殖及骨细胞矿化等方面。在BMPs之中，BMP2调节成骨分化能力最强[11]。当BMP2参与成骨分化时，会使启动子Cpg岛去甲基化，BMP2表达活性增强，进而调控通路下游参与骨形成基因如Dlx5、Runx2、Osterix的表达。Mehrun等[12]通过RT-PCR得出在病理状态下，BMP2启动子高甲基化会使BMP2的转录活性下降，造成骨形成减弱。然而关于BMP2表观修饰改变具体机制尚不清楚。Matsumoto等[7]发现BMPs家族另一具有骨特异性的成员BMP4，在MC3T3-E1细胞中受到雌激素调节后敏感性上调，进而影响成骨分化。故绝经期后雌激素水平骤降可能改变BMPs的表观修饰状态。

硬化蛋白(sclerostin，SOST)是调节骨形成的负性因子，缺乏SOST蛋白会导致骨密度异常升高。Sjur等[13]实验发现，在PMOP患者体内，SOST启动子甲基化程度显著升高，且与年龄相关。Yu等[14]发现在OP患者体内SOST高甲基化阻碍了SP7、Runx2和ERα的反式激活，进而使骨重建受阻。同时，SOST基因甲基化状态改变还与OP患者成骨细胞增殖和凋亡有关。

1.3 成骨与成脂分化中的DNA甲基化

各种原因导致的骨量下降常伴见脂肪浸润增加，BMSCs向成骨分化减少、成脂分化增多是骨质疏松症发病的重要机制之一[15]。Runx2作为多种成骨信号通路及调节蛋白的下游基因，是成骨细胞分化的标志。PPARγ是参与脂肪酸转运和代谢的重要调节因子。因此，Runx2和PPARγ的DNA甲基化程度对于BMSCs的分化命运有重要影响。Xu等[16]发现在脂肪组织来源干细胞(ATSCs)中，RUNX2启动子cpg岛呈高甲基化状态，在BMSCs中呈低甲基化状态。而PPARγ则刚好相反，其启动子在ATSCs呈低甲基化，在BMSCs中呈高甲基化。此外，Cho等[17]发现在脂肪前体细胞中成骨细胞标记碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和BMP2基因启动子 CpG岛发生了过度甲基化，使其不能受到Wnt3a调控进行成骨分化。

2 组蛋白修饰对绝经后骨质疏松症的影响机制

组蛋白是染色质基本单位核小体的组成部分，组蛋白八聚体被DNA缠绕形成核小体。组蛋白修饰往往发生在4种常见组蛋白 (H2A、H2B、H3和H4,尤以H3、H4较多) 的游离氨基端尾巴，常见的修饰种类包括组蛋白乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、泛素化/去泛素化和磷酸化等等。组蛋白修饰可通过改变基因的周遭环境，增强或减弱转录辅助因子对基因表达的作用；还可直接影响染色质的构造及状态，改变蛋白与基因之间的相互作用；亦能作为信号影响其下游基因的转录翻译，进而改变基因的表达[18]。

2.1 组蛋白去乙酰化

组蛋白乙酰化是最重要的组蛋白修饰机制之一。它与基因转录的激活与抑制密切相关，一般是组蛋白乙酰化激活基因转录，而去乙酰化则使基因转录受到抑制。这两种活动分别由分组蛋白乙酰转移酶(HAT)和去乙酰化转移酶(HDAC)调控。HDACs在骨重建过程中可以催化调节因子Runx2,NF-κB,p53发生组蛋白去乙酰化。敲除了HADC的小鼠会发生骨小梁变细、骨质流失和骨矿化下降[19]。Behera等[20]在实验中发现，HADC3通过使细胞因子发生组蛋白去乙酰化、提升NF-κB表达量两种途径抑制炎性细胞因子分泌。而炎性细胞因子如白细胞介素IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α是OC形成的关键因子。故HADC3可能通过调节炎性细胞因子参与到骨代谢当中。

Sirtuins(SIRTs)家族是NAD依赖性的去乙酰化酶，通常被认为是调控衰老的关键因子。而衰老与雌激素缺乏、持续性钙丢失一样，均是绝经期女性患骨质疏松症的独立易感因素[21-23]。在SIRTs家族中，Sirt1可与PPARγ共抑制因子NCOR和SMAT结合，降低PPARγ的活性，抑制细胞成脂分化。Sirts的NAD依赖性使得在其反应过程中[NAD+]/[NADH]的比率起到重要的调控作用。NAMPT作为NAD+生物合成的限速酶，通过调控NAD的生物活性参与Sirts的催化过程。而NAMPT自身也参与到骨稳态调节中，它能够抑制破骨细胞分化[24]。Li等[25]研究发现在CIA小鼠模型中，敲除NAMPT基因可导致Nfatc1基因组蛋白乙酰化程度下降而甲基化程度升高，认为NAMPT基因是调控Nfatc1启动子表观修饰的主要因素。Nfatc1在OC形成和功能发挥中起关键作用[26-27]，NAMPT通过NAMPT-RANKL-Nfatc1途径影响破骨分化，是骨重建失衡的重要原因之一。

2.2 组蛋白去甲基化

组蛋白甲基化具有影响基因的表达失活和激活、基因沉默和DNA修复等作用。组蛋白甲基化由多种组蛋白甲基转移酶催化，并且既可单独又可重复多次被甲基化。组蛋白去甲基化酶使得甲基化修饰具有可逆性。去甲基化酶主要有两类：一类是赖氨酸特异性去甲基化酶1 (lysine specific demethylase 1,LSD1)，一类是含有Jumonji结构域的蛋白质 (jumonji domain-containing protein,JMJD) 家族。其中，去甲基化酶JMJD 家族在骨代谢调节中起到重要作用。

在ER信号传递系统当中，LSD1和JMJD1A参与雌二醇(E2)与ER靶基因结合的过程。LSD1和JMJD1A催化ER靶基因组蛋白位点H3K9me2去甲基化，使其顺利转录[28]。另一组蛋白去甲基化酶JMJD2B与ERα结合，通过改变ER靶基因表观修饰状态和染色体结构，刺激靶基因应答[29]。JMJD2B还与H3的K4位点甲基化酶MLL2结合形成复合物，作为ER的共激活因子发挥功能[30]。郭承等[31]发现在PMOP患者骨组织中 JMJD2A、JMJD2B 基因和蛋白量均降低，且JMJD2A、JMJD2B的低表达与ER表达下降密切相关，故提出ER、JMJD2A、JMJD2B可能共同参与了PMOP的发病过程，但具体联系尚不清晰。Kim等[32]的实验发现JMJD2B通过降低H3K9me2和H3K9me3在PPARγ2启动子上募集，使PPARγ2表达上升，进而引起HFD诱导的肥胖小鼠发生肝脏脂肪变性。敲除了JMJD2B的HepG2细胞中，PPARγ2的mRNA和蛋白质含量均下降。故而JMJD2B对于PPARγ表达的调控，可能使得BMSCs向成脂分化增多而成骨减弱，导致PMOP发生。

3 非编码RNA对绝经后骨质疏松症的影响机制

非编码RNA通过调节转录和转录后修饰影响基因表达。ncRNA分为两大类：管家ncRNA和调节性ncRNA，后者在表观遗传修饰中具有重要地位。ncRNA根据长度和功能的不同可分为微小RNA(microRNA，miRNA)、PIWI相互作用RNA、siRNA、长链非编码 RNA(long non-coding RNA，ln-cRNA)、增强子RNA及启动子相关RNA。

3.1 microRNA

microRNA是长度为20～25 bp的小分子非编码单链RNA。大量实验证明miRNA既有可能对骨重建有积极作用，如miR-149高甲基化可以激活SDF-1/CXCR4途径提升MSCs成骨分化潜力[33]；又可能对骨重建有负面影响，如MiR-125A-3p通过靶向Smad4和Jak1负向调节hADSCs成骨分化[34]、miR-133a过表达会使Rankl介导的OC分化活跃造成骨质流失和PMOP发生[35]。miRNA还在BMSCs的分化命运中起重要作用，如miR-705负调控成骨促进因子Hoxa10和成脂抑制因子Foxo1蛋白的表达，下调Runx2、上调PPARγ表达，抑制BMMSCs成骨分化的同时促进其成脂分化[36]。

LeT-7作为最早发现的micro RNA之一，被证实参与衰老过程中的细胞分化、增值和凋亡[37]。闫娈等[38]的实验发现在行双侧卵巢切除术(OVX)的小鼠BMSCs中，雌激素下降导致leT-7a高表达，继而会使BMSCs向成脂分化增多而成骨分化减弱，BMSCs的增殖也会受到抑制。Wenpu等[39]的实验发现在PMOP模型小鼠的MSCs中leT-7A-5P表达显著高于对照组(P<0.05)，leT-7A-5P通过抑制TGF-β受体Ⅰ的表达影响TGF-β信号通路，下调成骨因子Runx2和Osterix，降低ALP和钙化结节的形成，抑制成骨分化。LeT-7c作为leT-7家族另一成员亦有类似作用。实验表明leT-7c在氧化应激和骨质疏松状态下表达活跃，能够靶向SCD-1降低其蛋白水平，关闭wnt/β-catenin信号通路，抑制OB分化[40]。

ERα、miRNA和BMSCs的分化方向都在PMOP的发生发展中扮演重要角色，然而它们潜在的分子机制和相关性仍不清楚。Li等[41]发现在ERα缺陷型大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)中，有25种miRNA表达上调，164种miRNA表达下调，其中不乏能够调节成骨成脂分化以及信号通路的miRNA，如miR-210-3p和miR-214-3p。进一步研究显示，在ERα缺陷型rBMSCs中，miR-210-3p通过Wnt信号通路抑制细胞成骨分化、促进成脂分化，导致rBMSCs成骨分化受限。这一发现说明PMOP的发病机制中可能存在一个以表观修饰为桥梁，雌激素受体及调节因子蛋白、相关DNA、RNA相互连接影响的调节网络，影响有关细胞的成骨分化。

3.2 LncRNA

LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，可以通过Wnt/β、PI3K-Akt、BMPs/TGF-β等多个信号通路促进OB的分化,也可通过RANK/RANKL/OPG、MAPK和PPAR-γ通路抑制OC的分化。

LncRNA可以通过调控骨代谢相关基因的表观修饰影响成骨分化。LncRNA-DANCR是调节成骨分化的重要介质。Xiang等[42]发现在绝经期低骨密度妇女的外周血单核细胞中，DANCR表达量明显上升。DANCR通过促进IL-6、TNF-α的表达，刺激破骨细胞生成，参与骨吸收过程。Zhu等[43]发现DANCR能够使EZH2募集于Runx2启动子，使其发生高甲基化，致使Runx2表达下降，成骨分化受到抑制。

LncRNA也可通过影响信号通路，调节BMSCs的分化方向。Li等[44]发现LncRNA-Bmncr可以调节衰老过程中BMSCs的分化命运。它可通过维持细胞外基质蛋白纤维调节素的表达和激活BMP2介导的信号通路刺激BMSCs成骨分化。Bmncr通过促进TAZ和ABL互相作用，使TAZ和Runx2/PPARG转录复合物结合，促进BMSCs成骨分化并抑制脂肪形成。此外，恢复人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中的Bmncr表达水平可以逆转年龄相关的成骨成脂分化失调。

LncRNA亦可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调节BMSCs定向分化。Yuan等[45]发现一全新长链非编码RNA：PGC1β-OT，其具有促进小鼠BMSCs成骨分化、抑制脂肪分化的功能。经机制研究发现，PGC1β-OT上含有miR-148A-3p结合位点。miR-148A-3p可以通过靶向Kdm6b来调节骨祖细胞的成骨成脂分化[46]。PGC1β-OT通过拮抗miR-148A-3p上调其靶基因Kdm6b的表达，从而达到促进成骨、抑制成脂的目的。

4 结语

表观遗传机制的存在既提供了大量的可供治疗针对的靶点，又提示人们可从改变表观修饰机制着手进行治疗。研究[47]显示miRNA是OP的重要治疗靶点，如淫羊藿-仙茅药调控miRNA-144治疗继发型骨质疏松。同时近年来发现的一系列表观遗传活性药物，可能也在OP的治疗中发挥一定作用，如BET蛋白拮抗剂JQ1可减少OVX大鼠骨质流失[48]；NMP调节OB/OC平衡、抑制炎性细胞因子，治疗OVX大鼠骨质疏松症[49]。在诊断方面，以循环miRNAs为首的一系列表观修饰被看作是新兴的骨病生物标志物，参与到骨病的早期诊断和鉴别当中[50-51]。

表观遗传学存在于绝经后骨质疏松发病机制中的方方面面，但其最主要的影响是改变了间充质干细胞、成骨细胞等关键细胞的正常分化。综合各类试验，可以窥见在PMOP的发病机制中，存在一个以表观修饰及其因子，联合DNA、RNA及相关蛋白的调节网络，影响基因表达。但是其上下游关系和调节的分子机制、为何会发生如上的表观遗传状态改变等问题，仍有待进一步研究。此外，文章收录的实验多是动物实验或体外实验，尚不足以解释人体的病理变化。接下来还应寻找表观遗传机制在人体内外的异同，建立起体内与体外研究的联系。相信随着更多系统性实验的面世，未来会对表观遗传是如何影响PMOP发病机制有更加全面、深刻的认识。