高密度脂蛋白对内皮祖细胞数量、功能的影响及其分子作用机制

郭琪 盛云龙 陈淑芳 段爽 宋智敏 杨娜娜

高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）在胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）中发挥重要作用，低于正常水平的高密度脂蛋白是动脉粥样硬化的重要危险因素。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在血管内皮的损伤修复中发挥重要作用，低于正常水平的内皮祖细胞也是动脉粥样发生发展的危险因素。内皮祖细胞水平与高密度脂蛋白水平同步变化，两者之间可能存在直接的相互作用。内皮血管损伤被认为是动脉粥样硬化的使动因素，高密度脂蛋白水平、内皮祖细胞水平各自与动脉粥样硬化存在明显的负相关关系，提示两者在疾病发展中的重要作用。研究表明，高密度脂蛋白能够提高内皮祖细胞的数量及功能，促进其分化，抑制衰老和凋亡，从而增强内皮祖细胞介导的血管内皮修复作用。提高高密度脂蛋白或其有效成分的水平能够发挥上述作用，遏制或延缓动脉粥样硬化的发生发展。

为了阐明高密度脂蛋白与内皮祖细胞之间的作用及作用机制，笔者以“高密度脂蛋白，内皮祖细胞”为检索词检索中文期刊数据库，以“HDL，EPCs”“high density lipoprotein，endothelial progenitor cells”为检索词检索PubMed 数据库，对搜索到的文献进行筛选整理。随后对筛选出的43 篇相关性较强的文献进行总结阐述。内容如下。

1 内皮祖细胞与动脉粥样硬化

1.1 内皮祖细胞的特征与确定 内皮祖细胞是一种造血干细胞，在体内分布广泛，可从骨髓、外周血、脐带血甚至脂肪组织中获得，具有分化生成内皮细胞和血管平滑肌细胞的潜能。缺氧环境能够诱导内皮祖细胞生成新生血管，增强缺血缺氧组织的血供，这种细胞数量减少也被考虑为临床前动脉粥样硬化的危险因素。内皮祖细胞能够吞噬乙酰化低密度脂蛋白（acety-lated low density lipoprotein，ac-LDL），也能够结合荆豆凝集素-1（ulex europaeus agglutinin-1，UEA-1），实验中常用Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 标记内皮祖细胞。

根据内皮祖细胞发育的阶段和特征可以把内皮祖细胞分为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞。早期内皮祖细胞又称为髓内皮祖细胞（myeloid EPCs）；晚期内皮祖细胞又称为内皮集落形成细胞（endothelial colony forming cells，ECFCs）。晚期内皮祖细胞成血管能力更强，具有部分内皮细胞的特征和功能，能够表达内皮型一氧化氮合酶。

1.2 内皮祖细胞的功能及其在动脉粥样硬化过程中的作用 动脉粥样硬化的发病机制尚未得到完全阐明，多种学说从不同角度对动脉粥样硬化进行了阐述。动脉粥样硬化的危险因素有高脂血症、代谢综合征以及继发高脂血症的其他疾病，硬化斑块中还可发现大量的胆固醇结晶及坏死物质，提示发病过程中存在大量血浆脂质向血管内皮以下浸润。炎症等因素可以加重内皮细胞损伤，破坏内皮损伤-修复平衡，使血管内膜通透性升高，加速脂质沉积从而导致动脉粥样硬化[1]。

促进内皮修复是防治动脉粥样硬化的靶点。血管内皮细胞具有分裂增殖能力，参与血管内皮修复。但成熟内皮细胞能力有限，对于较大规模的内皮损伤无能为力。较大的血管内膜损伤修复可由内皮祖细胞完成。在内皮（血管）修复过程中，内皮祖细胞能够对血管内皮损伤做出反应，从骨髓中动员增殖分化，迁移至内皮损伤位点发育为成熟内皮细胞。内皮细胞损伤坏死脱落释放的内皮细胞源微粒可能是内皮（血管）修复过程的诱发因素[2]。

内皮祖细胞还能够发育成血管平滑肌细胞。血管平滑肌细胞自身是粥样硬化斑块纤维帽的重要成分，也是纤维帽基质成分的主要生产者。血管平滑肌细胞及胞外基质组成的纤维帽保护作用远弱于血管内皮，不能防止血浆内脂质在血管壁内沉积。血管平滑肌细胞自身的增殖和分泌功能反倒会使硬化斑块扩大，加剧动脉狭窄，不利于动脉粥样硬化的治疗和预后。调控内皮祖细胞的定向分化也可视作动脉粥样硬化预防治疗的靶点。

内皮祖细胞能够出芽生成新生毛细血管，这一过程可由缺血缺氧组织诱导。内皮祖细胞沿动脉供血毛细血管进入动脉血管壁，在相对缺氧的粥样硬化斑块内部形成毛细血管。增强血供，加强斑块内炎症反应，降低斑块的稳定性。硬化斑块中存在有大量促血栓物质，斑块内新生毛细血管网使斑块内的促血栓物质与血液交通，造成血液高凝状态，促进血栓形成并加剧动脉狭窄。

2 高密度脂蛋白与动脉粥样硬化

高密度脂蛋白由脂质和蛋白质组成。脂质包括胆固醇和胆固醇酯，蛋白质包括载脂蛋白A1（apolipoprotein A1）、载脂蛋白A2（apolipoprotein A2）和少量的载脂蛋白E。高密度脂蛋白参与胆固醇逆向转运，调节内皮细胞代谢，具有抗炎作用[3]，具有重要的抗动脉粥样硬化作用，是抗动脉粥样硬化过程中的重要成分。

动脉粥样硬化斑块中存在泡沫细胞，内含有大量胆固醇及胆固醇酯，是胆固醇逆向转运过程的主要来源。高密度脂蛋白与泡沫细胞表面的ATP 结合盒转运蛋白A1（ATP binding cassette A1，ABCA1）分子结合，摄取细胞内的胆固醇及胆固醇酯，并改变外形，从饼状变成球状，这也是成熟的过程。成熟高密度脂蛋白回流入肝，与肝细胞表面的清道夫B1 受体（scavenger receptor class B type 1，SR-B1）结合，被肝细胞胞吞吸收，这一过程由高密度脂蛋白中的Apo A1 分子介导。

高密度脂蛋白能够调节内皮细胞代谢。高密度脂蛋白能够与内皮细胞表面的SR-B1 结合，升高内皮细胞eNOS 的表达水平[4]，并通过溶血磷脂受体S1P3 加强内皮依赖的血管舒张过程[5]。这一升高eNOS 水平的过程能被抗Apo A1 抗体或抗SR-B1 抗体阻断。

高密度脂蛋白具有抗炎作用，能从多个途径抑制内皮细胞凋亡。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是硬化斑块炎症反应中重要的细胞因子，能够上调内皮细胞CPP-32 样蛋白酶，导致内皮细胞凋亡。高密度脂蛋白能遏制TNF-α 诱导升高的CPP-32 蛋白酶，抑制内皮细胞凋亡。高密度脂蛋白能够维持内皮细胞线粒体膜电位，减少内皮细胞内活性氧的生成，抑制内皮细胞氧化应激，减少细胞色素C 的释放，抑制线粒体途径的细胞凋亡[6]。

高密度脂蛋白的质量及来源对生理效应有重要影响。从2 型糖尿病患者体内提取的高密度脂蛋白与内皮细胞的亲和力明显下降，不能促进内皮依赖的血管舒张功能。这种高密度脂蛋白的脂质过氧化水平显著高于正常人体内的高密度脂蛋白，可能是功能丧失的重要原因[7]。

载脂蛋白A1 是高密度脂蛋白的标志蛋白质，载脂蛋白A1 抗体能够阻断高密度脂蛋白的细胞代谢调节作用。单纯使用Apo A1 也能发挥高密度脂蛋白的部分作用。纯化的载脂蛋白A1 没有明显表现出HDL 的全面活性，因此常用开发的载脂蛋白A1 模拟肽（apolipoprotein A1 mimetic peptide）发挥类似的作用。载脂蛋白A1 模拟肽D-4-F 已经具备了部分高密度脂蛋白的作用及抗动脉粥样硬化潜能，能够抑制病毒感染继发的炎症反应。载脂蛋白A1 模拟肽又被称为高密度脂蛋白模拟肽。

3 高密度脂蛋白与内皮祖细胞

高密度脂蛋白含量、总胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇比值、甘油三酯/高密度脂蛋白胆固醇比值也与患者的心血管风险密切相关。内皮祖细胞数目与高密度脂蛋白浓度直接相关，但是与低密度脂蛋白含量无关[8]。高密度脂蛋白与内皮祖细胞之间独立存在的相关关系提示高密度脂蛋白对内皮祖细胞的直接作用及对心血管风险的影响。

3.1 高密度脂蛋白对内皮祖细胞生长特性的影响

3.1.1 高密度脂蛋白促进内皮祖细胞增殖 实验显示，健康人体内提取的高密度脂蛋白能够促进脐带血源的内皮祖细胞增殖，在一定范围内，这种促增殖作用具有时间依赖性和浓度依赖性[9]。随着浓度的升高，高密度脂蛋白对内皮祖细胞的促增殖作用越来越强，当升高到一定程度时，高密度脂蛋白对内皮祖细胞增殖表现出两重性，在250 μg/mL 以下促进增殖，250 μg/mL 以上抑制增殖。人体内几乎不可能达到这一浓度，因此抑制作用可忽略不计。临床试验中发现，高密度脂蛋白胆固醇确能够升高人体内的循环内皮祖细胞水平[10]。重组高密度脂蛋白也能发挥相似的作用。

高密度脂蛋白通过缩短细胞增殖周期，促进内皮祖细胞增殖。细胞增殖指数能反映细胞周期，具体计算方式为（S+G2）/（G1+S+G2）。实验显示，经过HDL 刺激的内皮祖细胞细胞增殖指数为21.4%，而未经刺激的对照组细胞增殖指数仅为15.3%，提高了40%。细胞增殖指数提高可以反映细胞分离周期缩短[11]。

3.1.2 高密度脂蛋白促进内皮祖细胞分化及抗原表达 高密度脂蛋白能够促进人外周血单个核细胞（mononuclear cells，MNC）分化成为内皮祖细胞。高密度脂蛋白孵化的MNCs 的DiLDL/lectin 阳性率比空白对照组高出37 个百分点，MNCs 中的eNOS的mRNA 和蛋白质分子含量也得到了显著升高[12]。DiLDL/lectin 阳性和较高的eNOS 水平是内皮祖细胞的重要特性。这些证据提示高密度脂蛋白加速了人外周血单个核细胞向内皮祖细胞的转化过程。

3.1.3 高密度脂蛋白促进内皮祖细胞的成血管作用和迁移能力 制取大鼠血管损伤动物模型，再将hEPCs 或者rEPCs 注入模型的血管损伤部位做短暂停留，发现损伤部位内皮细胞的增生及血管修复能力明显增强，且后者的促进作用要强于前者。E1E2E3 缺失的腺病毒LDL 受体载体（AdLDLr）能够降低C57BL/6 LDL 受体缺乏小鼠（LDLr-/-）的总体血脂水平，而E1E2E3 缺失的腺病毒人Apo-1 载体（AdA-1）能升高HDL 水平，这些小鼠体内分离出的EPCs 的迁移能力均有明显增强。NOS 抑制剂（L-NMA）能够抑制上述作用，提示HDL 发挥促进EPC 迁移的能力可能依赖于NO 合酶的活性，虽然目前尚无证据证明在降低血脂和使用HDL 基因转移子后NOS 的活性增强[13]。

3.1.4 氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞的反作用 除极高浓度，常规高密度脂蛋白对内皮祖细胞表现为促进作用，从糖尿病患者体内提取的高密度脂蛋白会降低人体体循环内皮祖细胞的水平，提示经过不同来源的高密度脂蛋白具有异质性，人工氧化修饰的高密度脂蛋白具有与之相似的效应。氧化高密度脂蛋白能够提高内皮祖细胞内ROS 水平，促进内皮祖细胞凋亡，抑制成血管能力和迁移能力[14]。

3.1.5 内皮祖细胞内化吸收高密度脂蛋白 高密度脂蛋白能通过细胞表面途径刺激内皮祖细胞，内皮祖细胞也能够通过胞吞作用消化高密度脂蛋白，后一作用可能涉及内皮祖细胞对营养成分的摄取，即通过吸收高密度脂蛋白上的物质组建细胞自身结构。

内皮祖细胞通过胞吞作用摄取高密度脂蛋白，并进行胞内转运。进入内皮祖细胞的高密度脂蛋白首先存在于与内体同源的内吞囊泡和多囊小体中，随后发展成溶酶体。含有高密度脂蛋白的溶酶体排列成行，相互之间连续不断，形成珍珠串样排列。多囊小体小体内及小体膜上的局限性强染色区域提示高密度脂蛋白在多囊小体中分布并不均匀。多囊小体中还存在有连接多个小囊的复合膜结构。

高尔基体数量增多并移动至细胞核周围，标记物并未出现在高尔基体内，但高尔基体内反应产物数目升高。内皮祖细胞能够胞吞高密度脂蛋白，形成早期内体后以囊泡转运的方式在细胞内转运。高密度脂蛋白在溶酶体中降解，降解产生的胆固醇和胆固醇油盐酸进入高尔基体，参与组成细胞膜、内质网、高尔基体及线粒体的膜结构，或以脂滴的形式贮存于细胞内[15]。

3.2 高密度脂蛋白对内皮祖细胞的作用通路

3.2.1 高密度脂蛋白通过SR-B1 受体作用于内皮祖细胞 SR-B1 是清道夫受体超家族的重要成员，该受体高度表达于成熟内皮细胞表面，能够接受高密度脂蛋白激动，上调内皮细胞eNOS 水平，促进内皮细胞依赖的血管舒张过程，在预防动脉粥样硬化中发挥重要作用。SR-B1 受体不仅表达于成熟内皮细胞表面，也表达于成熟内皮细胞的前体细胞—内皮祖细胞表面。高密度脂蛋白与内皮祖细胞表面的SR-B1 结合形成复合体，激动下游信号分子，调节内皮祖细胞的结构与功能。SR-B1 受体是内皮祖细胞接受高密度脂蛋白分子刺激的重要受体，是高密度脂蛋白调节血管内皮活性的重要物质基础。

3.2.2 高密度脂蛋白调节磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphoinostide 3-kinase，PI3K）/Akt 通 路 rHDL促进单个核细胞迅速分化成EPCs，细胞中的PI3K和Akt 水平也显著升高[16]。PI3K/Akt 通路抑制剂（LY29400210）降低PI3K/Akt 通路活性，抑制促分化作用。提示HDL 是通过此途径参与调节内皮祖细胞的分化过程。PI3K 具有磷脂酰肌醇激酶的活性和丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是细胞重要的信号调节分子。Akt（蛋白激酶B）是PI3K 的下游分子，与PI3K 联合构成PI3K/Akt 通路。

3.2.3 高密度脂蛋白升高cyclin D1 水平 HDL 可以促进Akt 的磷酸化过程和cycling D1 的表达，并且在一定范围内呈时间依赖性和剂量依赖性。在应用了PI3K/Akt 通路抑制剂（LY29400210 10 umol/L）处理后，cyclin D1 蛋白水平开始下降。cyclin D1 是PI3K/Akt 通路的下游分子，可能是高密度脂蛋白促增殖作用的中间产品。

3.2.4 高密度脂蛋白调节pro-MMP-9 水平 骨髓溶解产生的基质细胞衍生因子（SDF-1）能够上调MMP-9 的 表 达。MMP-9（matrix metallopeptidase-9）又称金属基质蛋白酶，能够促进基质细胞释放可溶性的Kit-ligand（sKitL），促进内皮细胞和造血干细胞（HSCs）从静息状态转向增殖状态。sKitL 的释放可以使骨髓再填充细胞转移到任意的血管龛内，帮助干细胞或者祖细胞的分化与重建。MMP-9 在骨髓源内皮祖细胞召集动员入血过程中发挥重要作用[17]。HDL 能够降低人外周血内皮祖细胞内pro-MMP-9 表达水平。pro-MMP-9 是MMP-9 的前体蛋白，经过活化之后发挥蛋白酶作用。提示HDL 能够促进细胞内原有的pro-MMP-9 向MMP-9 转化，促进血管新生。HDL 降低pro-MMP-9 水平还可理解成限制细胞溶解细胞外基质的能力，通过这一途径促进内皮祖细胞黏附及成血管，提高新生血管的稳定性。

3.2.5 高密度脂蛋白上调整合素水平 高密度脂蛋白通过上调β2 和α4 整合素水平发挥作用，提高内皮祖细胞的黏附能力。整合素是细胞间的整联蛋白，在细胞间的黏附、固定及形态维持中发挥重要作用。激肽释放酶能够通过上调整合素αvβ3 水平提高内皮祖细胞黏附能力，提示其与高密度脂蛋白具有协同作用[18]。

3.2.6 高密度脂蛋白升高eNOS 水平 eNOS 是内皮一氧化氮合酶，主要分布于内皮细胞中，利用L-精氨酸和氧生成NO 和L-瓜氨酸。一氧化氮对内皮祖细胞有重要的促进作用，NO 及NO 产生既在促进缺氧组织血管生成过程中、在包括内皮祖细胞在内的干细胞的动员迁移过程中发挥重要作用[19]，eNOS 水平升高可能是内皮祖细胞介导内皮修复的重要环节。高密度脂蛋白能够提高内皮祖细胞eNOS 表达水平，提高NO 的合成水平，从而促进内皮祖细胞增殖、迁移、分化和成血管。敲除NOS 基因上述功能消失。

3.2.7 高密度脂蛋白降低Caspase-3 水平 高密度脂蛋白能够降低细胞Caspase-3 水平，从而抑制细胞凋亡。Caspase-3 是Caspace 家族的重要成员，在细胞凋亡过程中发挥重要作用。Caspase（半胱天冬酶/cysteinyl aspartate specific proteinase）活性位点含有半胱氨酸残基，作用位点为其他蛋白质的天冬氨酸残基，是细胞内重要的蛋白水解酶家族。

3.2.8 氧化高密度脂蛋白调节CD36/p38 MAPK/NF-κB 通路 内皮祖细胞内存在CD36/p38 MAPK/NF-κB 通路，对氧化高密度脂蛋白激活该通路促进内皮祖细胞凋亡，发挥抑制作用。氧化高密度脂蛋白能够上调内皮祖细胞CD36 水平，抗CD36 抗体降低氧化高密度脂蛋白对于内皮祖细胞的抑制作用。氧化高密度脂蛋白能升高p38 MAPK 蛋白的磷酸化水平。氧化高密度脂蛋白能够升高NF-κB 水平。CD36 抗体能降低p38 MAPK 磷酸化水平，还能降低NF-κB 表达水平[20]。CD36 又称为清道夫受 体B3（scavenger receptor class B member 3，SRB3），是清道夫受体家族的重要成员。清道夫受体家族在人体脂质代谢中发挥重要作用。MAPK 全称为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），包括4 个家族，p38 是其中之一。MAPK 家族通过磷酸化发挥信号转导作用，是细胞内重要的信号分子。NF-κB 使细胞基因转录的重要调节分子，它的升高预示着细胞凋亡水平的升高。

高密度脂蛋白及内皮祖细胞在数量上同步变化，在动脉粥样硬化发生、发展、转归中均发挥重要作用。高密度脂蛋白能够增加内皮祖细胞的数量、增强功能，两者之间存在直接的相互作用。研究高密度脂蛋白相互作用内皮祖细胞的分子机制可以为预防和治疗动脉粥样硬化提供新的研究方向。