富勒烯及其多功能纳米粒光动力学治疗实验研究现状

刘梦婵，尤晓光

海南医学院第一附属医院放射科(海南 海口 570102)

现代光动力治疗(PDT)始于1970年并逐渐被证实，卟吩姆钠在1995年被批准用于治疗肺癌、胃癌、宫颈癌和膀胱癌[1-2]。PDT用于肿瘤治疗的机制主要是基态光敏剂经过特定波长的光照辐射，能够从基态跃迁到激发的单线态，再转变为激发的三线态状态，后者既能够与氧发生作用产生活性氧，又能够直接将能量传递给附近的氧分子形成单线态氧，单线态氧的氧化能力要高于三线态氧，能够破坏肿瘤中的微血管，造成局部缺血，使肿瘤细胞发生不可逆的损害，从而达到治疗肿瘤的目的[3]。本文对富勒烯(C60)的特点、C60及其多功能纳米粒应用于PDT的研究现状进行综述，综述如下。

1 C60及其多功能纳米粒光动力学概述

光动力作用发生有4个基本条件：①PDT所采用的光敏剂要求安全性能好，对机体无副作用，肿瘤组织选择性摄入高而正常组织不受影响，三线态光敏剂寿命长且产量多，常用的光敏剂有卟啉类和非卟啉类，C60是近年新兴的光敏剂，具有更高的三线态氧产率而无持续的光毒副作用；②PDT所需要的光一定是光敏剂所能吸收的频谱，并且要具有一定的组织穿透能力，光对组织的穿透性在可见光-红外光(400～900 nm)范围内随波长的增加而增加，第一代光敏剂的组织穿透力弱限制了光动力疗法在临床中的进一步应用；③合适浓度的氧；④适宜的温度[4]。目前光卟啉仍然是世界上最常见的光敏剂之一，但是其严重并且持续的皮肤光敏反应、波长在630 nm处利用率低以及穿透能力弱等缺点限制了光卟啉在临床上的进一步使用[5]，因此，许多领域的学者开始探索研究一种优于HPD的新型光敏剂。

C60是一种新兴光敏剂[6]，具备独特的物理和化学性质以及独特的生物学效应,其中最突出的生物学效应是C60的光动力学作用，应用前景广阔，最常见的C60是足球形结构的C60，所以C60也被叫作足球烯[7]，通过化学修饰可以显著提高其溶解度和生物相容性，这类经过化学修饰后的C60称为富勒烯衍生物，也被称为功能化C60，功能化C60可经过自组装形成纳米颗粒成为新型靶向药物运载体,功能化C60经可见光照射，能够从基态S0变成激发单线态S1，但单线态S1存在时间非常短(<1.3 ns)，很快就衰减为激发三线态，三线态状态长达50～100 μs[8]。与大多数光敏剂在光化学反应中倾向于发生Ⅱ型反应(产生单线态氧)相比，C60在光化学反应中更倾向于发生Ⅰ型反应(产生超氧自由基、羟基自由基、过氧化氢等产物)，在532 nm波长激光照射下，C60的单线态氧产率接近理论最大值[9]。C60抗肿瘤机制主要包括：①损伤DNA诱导肿瘤细胞凋亡：Shi J等[10]发现C60光动力治疗对MCF-7人乳腺癌细胞质粒DNA有剪切作用，DCFHeDA荧光探针检测MCF-7细胞中有大量到活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生，并发现DNA损伤的关键因素是ROS，为研究C60抑制肿瘤生长机制，对小鼠肿瘤进行凋亡水平检测，凋亡染色结果清楚地证实了C60是通过诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗目的。②抑制肿瘤细胞周期：Guo X等[11]通过实验表明C60光动力处理后HeLa细胞周期相对于空白组都发生了变化，处理后更多的HeLa细胞停滞在S期(DNA复制期)。

PDT和化学药物治疗相比，有明显的优势，它具有副作用小、治疗时间短、可重复治疗使用等优点，在适宜的光照作用下才表现光学毒性，没有光照时无明显细胞毒性，并且可以定位光疗靶组织，对正常组织影响小，可作为PDT的光敏剂应用。

2 C60介导PDT治疗的实验研究

C60作为一种优点多、缺点少的新型光敏剂，近年来已经在介导体内外PDT治疗方面得到了进一步研究。体内实验及体外实验中，可以看出多种肿瘤细胞和动物肿瘤模型对C60介导的PDT治疗表现出良好的敏感性。

1.1C60介导PDT治疗的体外实验Hamblin等[12]发现经过化学修饰的C60分子是有效的光敏剂，可以介导PDT治疗杀死一组小鼠肺癌(LLC)、结肠腺癌(CT26)和网状细胞肉瘤(J774)细胞，并且J774对C60介导的PDT的敏感性高得多，可能是因为J774细胞像巨噬细胞摄取C60增加，通过H2DCFDA荧光探针可检测到上述肿瘤细胞内ROS生成，激光照射4～6 h后CT26结肠腺癌细胞很快凋亡。Li Q等[13]通过构建壳聚糖包裹的C60纳米粒，研究人恶性黑色素瘤A375细胞中光动力体外治疗效果，实验发现C60处理后的A375细胞内产生大量ROS，并观察到线粒体是细胞中ROS产生的主要部位。Doshi M等[7]合成了一种以C60为原料的半导体聚合物,具有非常高的三线态氧产率，能够显著提高C60的光动力效应，实验结果显示该聚合物体外PDT后，人肺癌细胞A549死亡率达60%，人卵巢癌细胞OVCAR3死亡率高达100%。Yu C等[14]发现C60在体外PDT实验中，能诱导人纤维肉瘤细胞HT-1080和小鼠肉瘤细胞S180生成大量超氧自由基，呈现出光照时间依赖性，两种肉瘤细胞经C60激光照射处理后细胞存活率下降，并且S180细胞比HT-1080细胞更敏感。Franskevych等[15]发现C60照射前小鼠白血病细胞L1210存活率超过90%，C60激光照射24 h和48 h后的细胞存活率分别为70%和55%。Grebinyk等[16]发现C60在365 nm激光照射后，人白血病细胞CCRF-CEM细胞存活率为32%，在405 nm激光照射下，细胞存活率为16%。Asada等[17]发现包裹在聚乙二醇中的C60激光照射人纤维肉瘤细胞HT1080和DUMS16成纤维细胞，3 h后观察到HT1080细胞明显退化、微绒毛减少、细胞收缩、细胞分裂和核碎裂，而DUMS16成纤维细胞无变化。

1.2C60介导PDT治疗的体内实验Hamblin等[12]向荷瘤小鼠静脉注射C60后进行PDT，肿瘤生长受到抑制，小鼠腹腔癌模型可以观察到C60光动力治疗24 h后C60在腹腔癌灶聚集。Yu C等[14]化学合成C60，对S180小鼠肉瘤体内PDT，与对照组肉瘤占体质量比(11.24±3.36)%相比，C60光照处理组肉瘤体重占比降低到(1.93±1.62)%。

3 C60多功能化合物介导PDT治疗的实验研究

C60通过化学修饰可以显著提高其溶解度和生物相容性，因此，越来越多的研究聚焦于C60多功能化合物，C60不仅作为光敏剂发挥其光毒效应抗肿瘤作用，还能与化疗药物、功能肽等物质连接，协同抗肿瘤治疗。

3.1C60多功能化合物介导PDT治疗的体外实验Guo X等[11]构建DMA-C60/DTX-MC纳米复合物，研究结果表明该纳米复合物可有效地在小鼠皮肤黑色素瘤B16-F10细胞中产生活性氧，DMA-C60/DTX-MC诱导的细胞凋亡率高达46.4%，与对照组相比，DMA-C60/DTX-MC可使平均停留时间延长2.25倍和4.57倍，增加药物在肿瘤内的分布，增强抗肿瘤作用。Li Z等[18]在C60表面连接1-苯基丙氨酸或甘氨酸，在体外对肝癌细胞进行PDT治疗，明显观察到癌细胞凋亡及死亡，PDT治疗后加入2,7-二氯荧光黄双乙酸盐活性氧ROS检测试剂，可在肝癌细胞内见弥漫分布绿色荧光，证明PDT治疗能引起肝癌细胞产生大量活性氧，导致DNA裂解并能进一步促进癌细胞凋亡及死亡。Shi J等[19]构建DMA-C60-2ME-NGR靶向纳米药物输送系统，在可见光下用DMA-C60-NGR处理MCF-7细胞，结果表明DMA-C60-NGR组细胞DNA裂解片段明显多于对照组，并且显示实验组60%MCF-7细胞处于凋亡状态，表明DMA-C60-NGR在MCF-7细胞凋亡中起重要作用，体外DMA-C60-NGR-2ME(2-甲氧基雌二醇)处理MCF-7细胞，细胞死亡率高于单纯2ME，表明DMA-C60-NGR与2ME对抑制癌细胞生长有协同作用。Li Z等[20]合成C60-5-ALA(氨基酮戊酸)纳米粒，体外PDT实验结果显示C60-5-ALA组小鼠皮肤黑色素瘤B16-F10细胞存活率为(51.4±15.07)%，5-ALA组的存活率为(68.8±10.41)%，C60-5-ALA组增强了肿瘤细胞杀伤作用。Hu Z等[21]通过化学合成C60-PAD-rGO纳米复合物，体外对HeLa细胞PDT，C60-PDA-rGO光照处理9 min后，HeLa细胞存活率低至8.6%，PDA-rGO组细胞存活率为26.3%，证实C60能够显著提高肿瘤细胞杀伤作用。Shi J等[22]开发了一种C60-PEI-DOX纳米复合材料，体外对B16-F10细胞PDT，复合物显著提高了细胞对DOX的摄取，是单纯化疗药物摄取的两倍，细胞内检测到大量ROS生成，与对照组相比，C60-PEI-DOX组DNA裂解片段占比(50.4±6.7)%，C60-PEI-DOX/532 nm激光组DNA裂解片段占比(78.8±7.9)%，说明C60 PDT能够显著提高化疗药物杀伤细胞的能力。张孝焱等[23]通过合成C60-OH-GSH，体外PDT实验发现C60-OH-GSH能够诱导产生大量活性氧,使人恶性胶质母细胞瘤U87-MG、人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞Hep G2和人前列腺癌细胞DU145四种肿瘤细胞活性分别下降至60%～90%。Li Q等[24]化学合成了GO-C60，能诱导Hela细胞产生活性氧ROS，照射前GO-PEG细胞活力达95%以上，PDT后Hela细胞活力在7 min后下降为(58.52±4.65)%。Yan Y等[25]化学合成了C60-NH2和C60@GNPs，体外实验发现该化合物激光照射后能诱导人乳腺癌细胞MCF-7产生大量ROS，与对照组细胞存活率99.6%相比，C60-NH2和C60@GNPs532 nm激光24 h照射后的细胞存活率分别为66.7%和71.2%，并且C60@GNPs用808 nm激光照射24 h后细胞存活率低至63.2%。Hu等[26]合成了GO-FA/Py-γ-CD/C60纳米化合物，体外PDT实验结果表明激光照射4 min后，该化合物能诱导HeLa细胞产生ROS，并使HeLa细胞活力降低至16.2%。

3.2C60多功能化合物介导PDT治疗的体内实验Li Z等[20]在体内PDT实验中，发现C60-5-ALA组与5-ALA组相比，B16-F10肿瘤细胞内产生更多的原卟啉，肿瘤生长明显延迟。Shi J等[22]开发了一种C60-PEI-DOX纳米复合材料，体内荷瘤小鼠PDT实验后HE染色结果显示，C60-PEI-DOX在血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中DOX释放非常缓慢，48 h释放的DOX少于24%，而肿瘤部位的DOX出现相对较快，高达(57.4±6.9)%，说明C60-PEI-DOX使化疗药物快速在肿瘤区聚集，而不影响正常组织。

4 C60介导PDFT治疗多功能对比剂的实验研究

C60多功能对比剂是集靶向诊断成像与靶向光动力学治疗于一体的多功能纳米复合物，在纳米医学中，具有非常好的应用前景。

4.1C60光动力治疗多功能对比剂的体外实验Shi J等[10]合成C60-IONP-PEG-FA纳米粒，实验结果表明C60-IONP-PEG-FA在532 nm激光照射下对质粒DNA有剪切作用,检测到大量ROS生成，体外对MCF-7乳腺癌PDT，细胞凋亡率达73.7%，死亡率达10.1%，体外MCF-7细胞MRI成像，随着C60-IONP-PEG-FA浓度的增加，MCF-7细胞的MRI信号强度呈剂量依赖性降低,表明C60-IONP-PEG-FA作为有效的T2 MRI对比剂有靶向肿瘤细胞的能力。Du B等[27]通过化学合成C60/Fe3O4-UCNPs@DTX@SNSC纳米复合物，对MCF-7人乳腺癌细胞体外PDT治疗，实验结果显示C60光动力联合治疗，比单纯多烯紫杉醇DTX化疗更有效，可以在MCF-7人乳腺癌细胞内检测到大量活性氧。Du B等[28]合成C60-Fe3O4-PEG-folate/DTX多功能靶向热敏感脂质体，C60表面连接Fe3O4并被聚乙二醇包裹构成纳米粒，外层被脂质体包被，具有活性肿瘤靶向治疗和靶向MRI显像的功能，C60光动力治疗MCF-7人乳腺癌细胞能诱发细胞产生大量ROS，并进一步触发多烯紫杉醇DTX释放，光动力学PDT治疗联合药物化疗，选择性杀死癌细胞效果更显著；体外MRI成像可见明显负性强化，T2WI信号减低。Shi J等[29]通过化学方法将Au纳米颗粒连接到C60合成C60@Au纳米复合材料，通过PEG5000功能化形成C60@Au-PEG，在体外实验中，对MCF-7人乳腺癌细胞PDT，可以检测到细胞中有大量ROS生成，并且C60 @ Au-PEG光动力治疗过程中DNA损伤显著，DNA裂解片段含量高达(60.1±7.8)%。Guan M等[30]通过化学合成Gd金属C60复合物GFNCs-CDs-PEG，体外实验中，随GFNCs-CDs-PEG浓度增加，4T1-luc小鼠乳腺癌细胞MRI T1WI信号强度呈剂量依赖性增强，体外PDT发现GFNCs-CDs-PEG对4T1-luc细胞活力有近90%的抑制作用。

4.2C60光动力治疗多功能对比剂的体内实验Shi J等[10]合成C60-IONP-PEG-FA纳米粒，静脉注射小鼠体内，S180腋下小鼠活体MRI成像，3 h后T2WI观察到明显的肿瘤区变暗效应，活体PDT，2周后肿瘤缩小，62%肿瘤细胞发生凋亡。Du B等[27]通过化学合成C60/Fe3O4-UCNPs@DTX@SNSC纳米复合物，对活体小鼠腋下S180肉瘤模型体内PDT，实验结果显示2周后肿瘤抑制率高达70%；活体小鼠腋下S180肉瘤模型MRI成像，T2WI明显负性强化，肿瘤变黑。Du B等[28]合成C60-Fe3O4-PEG-folate/DTX多功能靶向热敏感脂质体，体内小鼠活体MRI成像可见明显负性强化，T2WI信号减低。Shi J等[29]合成C60@Au-PEG/DOX纳米复合物，体内实验中，C60@Au-PEG/DOX光动力治疗活体小鼠腋下S180肉瘤，比单纯化疗抑制肿瘤生长效果更显著，体内成像，将C60@Au-PEG/DOX静脉注射到荷瘤小鼠体内，8 h后可以观察到肿瘤区密度增高。Guan M等通过化学合成Gd金属富勒烯复合物GFNCs-CDs-PEG，体内实验中，用7T MR扫描仪在对荷瘤小鼠进行体内MR成像，发现肿瘤区明显强化，活体PDT治疗后，GFNCs-CDs-PEG对肿瘤生长有明显抑制作用，HE染色结果显示肿瘤细胞被明显破坏。

综上所述，C60及其多功能纳米粒不仅能够作为体内外肿瘤光动力学治疗的高效光敏剂，还能在纳米医学中构建肿瘤靶向药物输送系统起重要作用，应用前景广阔，为临床肿瘤诊治开拓了一条新的思路。