单核细胞趋化蛋白-1在球囊损伤术后大鼠颈动脉内膜的表达及对人参皂苷Rg3的作用

蹇明辉 陈文明 石蓓

(遵义医科大学附属医院心血管内科，贵州 遵义 563099)

经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)是当前治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的主要手段，但术后3～6个月支架内再狭窄的发生率高达30%～50%，即使应用药物洗脱支架，再狭窄的发生率仍有5%～10%，由此可见，支架内再狭窄的发生仍是PTCA后的主要的并发症〔1〕。因此，预防PTCA后再狭窄的发生显得尤为重要。人参皂苷Rg3是从人参中提取的一种四环三萜皂苷类化合物，具有诱导肿瘤细胞凋亡〔2，3〕、抑制肿瘤细胞侵袭和转移〔4〕、与化疗联合协同增效〔5〕、提高机体免疫力〔6〕等方面的药理学活性。本课题组前期研究结果发现，球囊损伤大鼠颈动脉内膜后，人参皂苷Rg3能通过促进血管平滑肌细胞的凋亡〔7〕，并抑制相关炎症因子表达〔8〕，减轻损伤后血管内膜的增生作用。本研究进一步观察血管内膜损伤后单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的表达及变化规律，并探讨人参皂苷Rg3对 MCP-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠50只，体重(300±20)g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，动物使用合格证号SCXK(渝)2017-0005。在普通级清洁环境下正常饲养，温度20～24℃，自由饮水、进食。

1.2药品与试剂 纯度98%的人参皂苷Rg3购自上海笃玛生物科技有限公司；蛋白抗体MCP-1和β-actin购自北京博奥森生物技术有限公司；免疫组化试剂盒购自中山生物公司；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒和RNA逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3仪器 2.0×12.0 mm球囊导管购自美国 Baxter Healthcare 公司；正置荧光电子显微镜购自日本Olympas公司；荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.4实验分组 50只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组，模型组(3、7、14 d)、人参皂苷Rg3分10 mg/(kg·d)组共5组，每组10只。假手术组只行左颈总动脉血管分离术，其余各组均进行球囊损伤术。人参皂苷Rg3组于术后待大鼠清醒后开始灌胃给药，连续14 d。

1.5制备模型 根据本课题组已成熟的球囊损伤颈动脉术建立动物模型〔7，8〕，分别取各组左颈总动脉进行病理形态学观察，用免疫组织化学染色和荧光定量法PCR观察MCP-1的表达。

1.6苏木精-伊红(HE)染色 球囊损伤颈动脉术后3，7，14 d，各组用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后分离颈动脉，取损伤中段部位血管0.5 cm，用生理盐水洗去血迹，4%多聚甲醛固定24 h，经脱水处理后石蜡包埋，行HE 染色，在正置光学显微镜下观察结果并拍照。结果用IPP图像分析软件测量损伤血管的内膜厚度、中膜厚度和血管管腔面积，并计算内膜/中膜的面积比率。

1.7免疫组织化学染色检测MCP-1的蛋白表达 取石蜡块均匀切片，进行免疫组织化学染色，具体实验操作按照免疫组织化学试剂盒说明书进行。在显微镜下观察颈动脉血管组织中出现棕黄色颗粒，即为 MCP-1 蛋白阳性表达信号，分别拍摄各组图片，采用IPP图像分析软件进行结果分析。

1.8RT-PCR 检测MCP-1的mRNA表达 术后3、7、14 d，各组经麻醉后分离颈动脉，取损伤血管，用Tripure试剂提取总RNA，用核酸蛋白测定仪鉴定RNA纯度和量。将RNA逆转录为cDNA，逆转录反应条件：①逆转录反应37℃、15 min；②逆转录酶的失活反应85℃、5 s，样本4℃保存。进行PCR反应扩增，其步骤：①预变性(1个循环)：95℃变性5 min；②PCR反应：95℃ 30 s，65℃ 30 s退火、延伸，45个循环；③融解曲线：95℃ 10 s，55℃ 1 min。待扩增反应结束后，CT值采用2-△△Ct法进行分析，比较各组目的基因表达变化。引物序列及扩增长度见表1。

表1 RT-PCR 引物序列和扩增产物长度〔9〕

1.9统计学分析 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜形态学指标变化情况 假手术组颈动脉血管内膜光滑，没有明显增厚现象；损伤3 d，颈动脉血管内膜开始增厚，7～14 d，颈动脉血管内膜不断增厚，内膜/中膜厚度比值逐渐增加，血管管腔不断缩小；与模型组(损伤14 d)相比，人参皂苷Rg3组颈动脉血管内膜增生明显减轻，内膜/中膜厚度比值降低，血管管腔明显增大(图1、表2)。

2.2各组增生内膜MCP-1蛋白表达水平 假手术组颈动脉血管有少量 MCP-1表达；损伤3 d，颈动脉血管内膜侧局部可观察到 MCP-1 蛋白表达开始增强(棕褐色阳性颗粒明显增多)，7～14 d，随着损伤时间延长，内膜逐渐增厚，增生内膜中 MCP-1 阳性颗粒的数量逐渐增多，颜色不断变深，平均光密度值逐渐增大，14 d 达峰值；与模型组损伤14 d相比，人参皂苷Rg3组新生内膜中棕色颗粒明显减少，颜色变浅，平均光密度值明显减小(图2，表2)。

图1 球囊损伤后各组颈动脉血管内膜形态学的变化(HE染色，×200)

表2 球囊损伤后各组颈动脉血管内膜、中膜的变化及MCP-1蛋白、mRNA水平比较

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组损伤14 d比较：3)P<0.01

图2 球囊损伤后各组增生内膜 MCP-1蛋白表达(免疫组织化学，×400)

2.3各组增生内膜 MCP-1 mRNA表达水平 假手术组颈动脉血管MCP-1 mRNA表达水平较低；模型组损伤 3 d，颈动脉血管MCP-1 mRNA表达水平开始增加，7～14 d，随着损伤时间延长，内膜逐渐增厚，颈动脉血管 MCP-1 mRNA表达水平逐渐增加，14 d达峰值；与模型组损伤14 d相比，人参皂苷Rg3组颈动脉血管 MCP-1 mRNA表达水平明显下降，见表2。

3 讨 论

PTCA后损伤血管内膜过度增生，导致血管再狭窄的发生，其中血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移是造成内膜增厚、新内膜形成和血管再狭窄的重要环节。本实验通过建立球囊损伤大鼠颈动脉模型，以此模拟血管发生再狭窄的反应过程，结果与韩雅玲等〔10〕报道一致。

炎性因子介导的各种炎性反应在PTCA后血管再狭窄的形成中发挥着重要的作用。MCP-1是一个重要的促炎细胞因子，属于CC趋化因子家族的一个小细胞因子，具有诱导单核/巨噬细胞趋化和激活单核/巨噬细胞的双重作用。在血管平滑肌细胞的表面存在MCP-1受体有利于MCP-1诱导损伤血管平滑肌细胞的增殖和迁移，参与PTCA后新内膜的增生过程。研究证实，在大鼠颈动脉球囊损伤后MCP-1基因表达明显高于正常血管〔11〕；在冠心病患者PTCA后血浆中呈高水平表达的MCP-1能通过影响血管重塑而参与冠脉支架术后再狭窄的发生过程〔12，13〕。本研究提示，MCP-1参与血管再狭窄发生的病理过程。

近年来，对中医药防治 PTCA后再狭窄的研究已经有所突破。单味中药及其提取物如川芎嗪、葛根素、水蛭素、雷公藤红素、花刺参黏多糖、三七总皂苷等及中药复方如血府逐瘀汤、抵当汤、补阳还五汤、四逆汤、冠心通络方、通冠胶囊、芎芍胶囊等都显示具有抗血管再狭窄作用〔14，15〕。本研究提示，人参皂苷Rg3抑制了球囊损伤后颈动脉血管MCP-1的表达。

总之，内皮损伤后MCP-1的表达参与血管再狭窄过程，人参皂苷Rg3能抑制血管内膜损伤后引起的内膜增生，可能与抑制MCP-1表达有关，但具体的作用机制有待进一步研究。