早期反应基因在宫颈癌中表达及其与人乳头瘤病毒感染的关系

李素芳 徐宏仙 莫政 黎世贵 万妮娅

(三亚市中医院，海南 三亚 572000)

宫颈癌是中老年女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发生与分娩次数、性行为开始时间和频率、家族遗传等多种因素有关，其中高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是最主要的危险因素〔1〕。研究者发现，约95%的宫颈癌患者可检出高危型HPV，其中HPV16、HPV18是最常见的两个亚型〔2〕。早期反应基因(Iex-1)最先由研究者在小鼠成纤维细胞中发现，当受到多种刺激后，可迅速短暂性表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学效应〔3〕。已有研究发现，多种人体恶性肿瘤中存在Iex-1表达失调〔4〕；但关于宫颈癌细胞和组织中Iex-1表达研究较少，且与高危型HPV感染是否相关尚未阐明。本研究以不同宫颈病变组织标本和3种不同HPV感染情况的宫颈癌细胞系为研究对象，探讨宫颈癌组织和细胞中Iex-1表达特点及与高危型HPV感染的相关性。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2016年1月至2018年3月三亚市中医院病理科留存的宫颈病变组织石蜡包块61份，其中宫颈良性病变13例，年龄48～72岁，平均(52.87±10.02)岁。宫颈上皮内瘤变23例，Ⅰ级9例、Ⅱ级8例、Ⅲ级6例，年龄46～70岁，平均(54.27±9.73)岁。宫颈癌25例，宫颈癌国际妇产科联盟(FIGO)临床病理分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期10例、Ⅲ期5例、Ⅳ期2例；分化程度：高分化9例、中分化8例、低分化8例。上述患者均接受放化疗和生物治疗；本研究经医院伦理委员会批准。

1.2细胞与试剂 人宫颈癌细胞株C-33A(HPV-)、SIHA(HPV16+)、HELA(HPV18+)购于上海钰博生物科技有限公司。Iex-1免疫组化试剂盒购于南京赛泓瑞生物科技有限公司。细胞总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购于上海泽叶生物科技有限公司。兔抗人Iex-1多克隆抗体、鼠抗人E6单克隆抗体、羊抗兔IgG二抗、兔抗鼠IgG二抗购于上海康朗生物科技有限公司。

1.3免疫组化法检测宫颈病变组织中Iex-1表达 采用免疫组化SP法检测，宫颈病变组织石蜡包块4 μm连续切片，染色步骤严格按试剂盒说明。光学显微镜下观察阳性细胞比例和染色强度，进行半定量评分。其中阳性细胞比例<5%计0分，5%～25%计1分，>25%且≤50%计2分，>50%且≤75%计3分，>75%计4分；无染色不计分，淡黄计1分，棕黄计2分，褐色计3分。阳性细胞比例和染色强度评分的乘积为最终得分，阴性(0分)、弱阳性(1～4分)、阳性(5～8分)、强阳性(9～12分)。

1.4实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测宫颈癌细胞株中Iex-1 mRNA表达 Triozl法提取C-33A、SIHA、HELA宫颈癌细胞株总RNA，逆转录得到cDNA，Iex-1、β-actin引物合成由上海泽叶生物科技有限公司完成。引物序列：Iex-1上游5′-GAGCTCCATCACTGTAGTCG-3′，下游：5′-TTAAGAGTTTCCC GTGAGCT-3′；β-actin上游5′-CATTCCCTACAATGACGTCGGTTGTG-3′，下游：5′-ATAGCAACGGGATACGGGATAGCGGT-3′。反应体系30 μl，条件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40个循环，72℃延伸10 min。计算Iex-1 mRNA相对表达量。

1.5Western印迹法检测宫颈癌细胞株中Iex-1蛋白表达 C-33A、SIHA、HELA宫颈癌细胞株中加入蛋白裂解液，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量，蛋白浓度调整至4 μg/μl，分别取50 μl行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离目标蛋白，转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜封闭60 min，滴加兔抗人Iex-1多克隆抗体(1∶100)，以兔源性β-actin(1∶1 000)为内参，4℃孵育过夜，洗膜后滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，室温下静置2 h，电化学发光(ECL)显色，放入凝胶成像系统中读取各条带灰度值。

1.6siRNA制备与分组 由上海泽叶生物科技有限公司公司设计并合成HPV16 E6特异性siRNA序列和阴性序列siRNA-nc，分别转染SIHA细胞，为干扰组和阴性对照组，并设立空白对照组，每组6个平行对照。

1.7siRNA干扰后SIHA细胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白表达检测 转染48 h后，Triozl法提取3组SIHA细胞中的总RNA，逆转录得到cDNA，E6引物序列：上游5′-GCTGACCTGAATCTCTAAC-3′，下游：5′-ATAATCCCACCGGCTACTA-3′；Iex-1上下游引物、反应体系和条件同1.4。转染48 h后，提取3组SIHA细胞中蛋白质，定量后调整浓度至4 μg/μl，分别取50 μl行SDS-PAGE，分离目标蛋白，转膜至PVDF，封闭60 min，滴加鼠抗人E6单克隆抗体(1∶500)、兔抗人Iex-1多克隆抗体(1∶100)，以兔源性β-actin(1∶1 000)为内参，4℃孵育过夜，洗膜后滴加HRP标记的兔抗鼠IgG二抗(1∶2 500)、羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，室温下静置2 h，ECL显色，放入凝胶成像系统中读取各条带灰度值。

1.8统计学分析 使用SPSS21.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1不同宫颈病变组织中Iex-1表达 宫颈良性病变、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织中Iex-1表达阳性率依次显著下降(P<0.01)。见表1。

表1 不同宫颈病变组织中Iex-1表达比较〔n(%)〕

2.2Iex-1表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系 Iex-1阳性率在不同病理类型、FIGO分期的宫颈癌患者中差异无统计学意义(P>0.05)；分化程度为G1～G2的宫颈癌患者Iex-1阳性率明显高于分化程度为G3的患者(P<0.05)；无宫旁浸润、有淋巴结转移的宫颈癌患者Iex-1阳性率明显高于宫旁浸润、无淋巴结转移的患者(P<0.05)。见表2。

表2 Iex-1表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.3不同宫颈癌细胞株中Iex-1 mRNA和蛋白表达 不同HPV感染状态的宫颈癌细胞株中，C-33A细胞株Iex-1 mRNA表达水平明显高于SIHA、HELA细胞株(P<0.05)；C-33A细胞株Iex-1蛋白表达水平明显高于SIHA、HELA细胞株(P<0.05)。SIHA细胞株和HELA细胞株Iex-1 mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图1。

2.4siRNA干扰后SIHA细胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白表达 干扰组SIHA细胞中E6 mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)；干扰组SIHA细胞中Iex-1 mRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组E6 mRNA和蛋白、Iex-1 mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表4。

表3 不同宫颈癌细胞株中Iex-1 mRNA和蛋白相对表达

与SIHA相比：1)P<0.05；与HELA相比：2)P<0.05

图1 Western印迹法检测不同宫颈癌细胞株中Iex-1蛋白表达

图2 Western印迹法检测SIHA细胞中E6、Iex-1蛋白表达

表4 siRNA干扰后SIHA细胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白相对表达

与空白对照组相比:1)P<0.05；与阴性对照组相比:2)P<0.05

3 讨 论

我国每年约20万例新发宫颈癌患者，约占全球新发患者总数的1/3〔5〕。中老年是宫颈癌的高发期，高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的首要原因，其中16型和18型是最主要的宫颈癌致病HPV亚型〔6〕。在高危型HPV DNA向宿主基因组整合过程中可引发HPV主要癌蛋白E6持续高表达，通过多种途径引发细胞周期紊乱，提升基因组不稳定性，降低细胞凋亡率〔7〕。Iex-1广泛分布于人体各组织器官中，在不同类型肿瘤中发挥促进或抑制癌细胞增殖、转移的双重作用〔8〕。

本研究提示随着宫颈病变程度的加重，Iex-1表达水平明显下降甚至缺失，可能参与宫颈癌的发生、发展。同时也说明在宫颈癌细胞中Iex-1发挥抑癌因子作用，促进癌细胞凋亡、抑制增殖，临床中可作为监测宫颈癌发展的生物学标志物。尽管高危型HPV是引发宫颈癌的危险因素已得到证实，但HPV致癌过程中相关的信号通路仍未完全阐明。P53、细胞外信号调节激酶(Erk)、蛋白激酶B(AKT)等多种因子参与了Iex-1及HPV E6信号通路〔9〕。

相关研究显示，HPV E6蛋白与P53相互作用，参与正常细胞向癌细胞的恶性转化〔10〕。Iex-1的启动子区域中含有P53特异性结合位点，研究者发现，p53调节Iex-1表达的准确性和敏感性均较好，进而影响癌细胞增殖和凋亡〔11〕。亦有研究发现，HPV16 E6蛋白可明显提升核因子(NF)-κB的活性亚基NF-κB P65表达水平〔12〕；HPV18 E6蛋白在调控HELA宫颈癌细胞核因子NF-κB P65表达及磷酸化方面发挥重要作用〔13〕。Iex-1基因的C端能够与REL/P65特异性结合，抑制NF-κB靶基因BCL-xl、Clap1表达〔14〕；Iex-1还能够抑制IΚBα降解，下调NF-κB表达水平〔15〕。上述两个调控途径均能够抑制NF-κB的抗凋亡作用。

本研究显示，HPV阳性的宫颈癌SIHA、HELA细胞株中Iex-1 mRNA和蛋白表达水平均明显低于HPV阴性的宫颈癌C-33A细胞株；使用siRNA特异性沉默SIHA细胞中E6表达后，Iex-1 mRNA和蛋白表达水平明显提升，提示宫颈癌组织中Iex-1表达与是否存在HPV感染有关，HPV可能经某些信号通路下调Iex-1表达，促进宫颈癌发展与转移。本研究结论首次提出了抑制Iex-1的促凋亡作用可能为HPV诱发宫颈癌的新通路，通过特异性沉默宫颈癌细胞E6蛋白表达来提升Iex-1活性有望成为宫颈癌治疗的新途径。