循环肿瘤细胞的检测及其在结直肠癌中的研究进展

申璐先，解广东，荣宝海，王 猛，陈希琦，周永坤

统计研究显示，2018年全球新发癌症1810万例，其中结直肠癌（colorectal cancer，CRC）180.1万例，位于第3位，占所有肿瘤发病人数的10.2%[1]。结直肠癌是美国第三大常见癌症，也是导致癌症死亡的第二大原因[2]。近年来，我国CRC发病率逐年上升，2015年CRC的发病率和死亡率均位于所有恶性肿瘤的第5位[3]。目前，肠镜检查、癌胚抗原检查、影像学检查及组织病理学检查的分期评估是制定治疗方案的重要依据[4]。远处器官转移是影响CRC预后的独立危险因素，也是患者死亡的主要原因，尽管进行了根治性手术和辅助治疗，II～III期CRC患者仍约有25%～50%的复发率[5]。

因此，临床上需要一个具有前瞻性的生物标志物，以便于更好地对CRC进行早期诊断，监测复发转移、评估治疗效果、预测长期预后。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTCs）是目前广泛研究的生物标志物。CTCs检测被称为“液体活检”，与组织病理学检查相比，液体活检的侵入性更小，其基本检测方法是在容易获得的体液样本中检测特定的生物标志物[6]，外周血是最常见的样本，而尿液、唾液、胸腔积液和腹水等也可用于检测。与传统组织活检相比，液体活检具有微创、取材方便、易于重复等优点[7]。本文总结近年来CTCs的检测技术，并探讨其在CRC诊治中的应用价值。

1 CTCs概述

CTCs是在实体肿瘤患者血液中发现的一种罕见细胞亚群，它们穿过血管壁后进入血液，肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，最终发展为转移灶，形成远处器官的继发性肿瘤，这个假说是由澳大利亚学者Ashwonh在1869年首次提出来[8]。CTCs仅存在于肿瘤患者体内，其逃逸机制可能是通过上皮－间充质转化机制逃避免疫系统，在外周循环系统与淋巴系统的帮助下进入血管中[9]。CTCs在肿瘤特异性抗原和基因学特征方面与原发肿瘤病灶高度相同，都具有极高的肿瘤特异性，可用于恶性肿瘤的体外“液体活检”[10]。相对于传统的影像学和肿瘤标志物的检查，检测外周血中的CTCs具有灵活、快捷、无创等特点，对于早期发现肿瘤、动态监测疗效和评估预后等都具有极高的临床应用价值。CTCs被美国FDA认定为癌症发展和监测的新的生物标志物[11]。

2 CTCs检测

在过去几十年中，研究人员致力于CTCs分析，CTCs的高敏感性和特异性的分离和表征在技术上已有明显的突破[12]。但是对于如何定义CTCs所需的和充分的最低标准没有共识；研究者们也不经常把两项研究的数据进行比较[13]。CTCs的生物和物理特性已被国际公认明显不同于血液中的其他细胞[14]，这些细胞在血流中表现出极端的表型异质性和罕见性。如CTCs在外周血的浓度极低，仅为几百万分之一[15]，CTCs在血液中半衰期约为1～2.4 h[16]，在循环系统中只有极少数高活性、高转移性的单个独立存在肿瘤细胞才能存活下来[17]。CTCs的鉴定仍具有极高技术挑战性。迄今为止，CTCs分离富集技术大致分为两类，一是利用CTCs的物理特性；二是利用CTCs表面标记的免疫分选方法。

2.1 CellSearch系统 CellSearch系统已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于监测乳腺癌、结肠癌和前列腺癌治疗的反应[18]。该系统是将磁性细胞分选技术、荧光抗体染色和半自动荧光显微镜分析技术相结合，具有敏感度高、结果稳定、检测过程统一等特点。Cohen等[19]利用该系统检测430例转移性CRC患者外周血中CTCs数量，得出CTCs的数量是影响转移性CRC患者无进展生存期和总生存期的独立因素。

2.2 微流控设备检测 微流控设备检测是一种基于微流体收缩和电流传感系统的机械低通滤波技术，其利用CTCs和血细胞的最佳收缩宽度不同，通过调整收缩宽度、信号强度和停留时间，从而切断血液细胞的信号，增强CTCs收缩通道。该设备相对于传统的抗体检测可避免存在假阴性，在细胞不经任何表面的生化修饰的情况下从全血中直接检测CTCs。Suzuki等[20]证实在没有预处理或稀释的全血中，设定6 μm宽收缩通道检测CTCs，其在几十毫秒的精度大于95%。

2.3 纳米结构界面 近年来随着纳米科技的进步，在众多CTCs检测策略中，纳米结构界面已被广泛应用。纳米粒子具有体积小、易与不同配体修饰、表面体积比高等优点，同时核酸适配体具有亲和性好、成本低、易修饰、稳定性好、免疫原性低等优点，这二者都促进了纳米结构界面在检测CTCs中的应用[21]。Wang等[22]利用滚环扩增产生的具有章鱼臂形态的磁性DNA纳米爪来捕获癌细胞，因该爪结构具有较好的刚性和柔韧性，且可携带多种抗体，故捕获率高达95%，纯度约达85%。

2.4 微流控芯片 微流控芯片技术成本低、通量高、样品需求量小，可达到特异、灵敏、高捕获率的效果，该技术是基于CTCs的生物学性质差异和物理性质差异来进行肿瘤细胞的分选富集[23]。Toner实验室设计了“CTCs-iChip”芯片，该芯片可依赖或不依赖肿瘤表面特异性表达在全血中快速的筛选CTCs，因而适用于所有癌症[24]。Yang等[25]设计的“CTCs-△Chip”楔形芯片实现肿瘤细胞与常规血细胞大小差异及三色免疫细胞化学方法(CK+/CD45-/Nucleus+)鉴定标记CTCs，并证实该系统在不同类型的固体肿瘤2 ml外周血中，可检测出2～15个CTCs，检测灵敏度高，检出率为75%。

3 CTCs在CRC的临床价值

传统上，需要通过组织活检来确定肿瘤的组织学性质及其遗传概况，但因肿瘤的异质性，组织活检常常存在假阴性、创伤大、成本高等缺点[26]。相对于传统的检测方式，CTCs易于从外周血中获得，可在没有入侵的情况下对肿瘤进行生物学监测，也可对肿瘤的进展进行重复评估。研究表明，CTCs在评估非转移性和转移性CRC的预后方面具有很高价值[27]。

3.1 CTCs对于早期CRC的诊断价值 在临床中，结直肠早期症状是隐匿的，无明显特异性。因此，大多数CRC发现时已为中晚期，其治疗效果及预后较差，故为了提高CRC患者5年生存率，早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。曹霞等[28]通过富集-免疫荧光原位杂交（SE-iFISH）技术检测67例早中期CRC患者及同期20例健康志愿者外周血中CTCs，得出早中期CRC患者CTCs阳性率为91.0%，明显高于健康人的5.0%。郭华等[29]应用CyttelTM-CTCs平台检测57例CRC患者及29例良性病变和健康受试者外周血标本，结果显示57例CRC患者中CTCs阳性45例，而良性病变和健康受试者仅2例，前者比后者检出率高(78.9% vs 6.9%)。Wen-Sy等[30]通过肠镜检查从620例CRC患者中筛选出438例诊断为腺瘤性息肉或早期至晚期CRC患者，然后进一步进行CTCs检测，发现其中111例(25%）为癌前病变，327例（75%）为CRC，CTCs检出癌前病变的灵敏度为76.6%，特异度为97.3%；检出CRC的灵敏度为86.9%，特异度为97.3%。CTCs检出癌前病变和CRC的准确率达到88.0%。因此，检测CTCs有利于CRC的早发现、早诊断、早治疗。

3.2 CTCs与CRC分期 晏玉武等[31]通过检测71“例”结直肠患者的CTCs发现，根据临床TNM分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）、淋巴结转移状况（N1、N2、N3）、肿瘤浸润深度（T1、T2、T3、T4)和肿瘤分化程度（高分化、中分化、低分化），CTCs阳性率跟以上几项均呈正相关。Tsai等[32]研究指出早期CRC患者肿瘤大小、位置、分化程度、转移程度等方面均影响着CTCs的水平，且CTCs数量随T分期增加而增加。还有研究发现CTCs阳性与TNM分期有关，术后CTCs的数值与侵袭深度及肿瘤部位显著相关，术前及术后CTCs水平与年龄、性别、肿瘤病灶的分化程度无关[28，33]。因此CTCs可作为CRC肿瘤分期的依据，可与组织活检相结合，为CRC患者提供进一步治疗指导。

3.3 监测CRC术前和术后CTCs的变化评估预后 在众多影响外周血中CTCs数量的原因中，手术操作是一个极为重要的因素，术中肿瘤组织受到挤压、牵拉等机械损伤，易导致肿瘤细胞脱落入血，影响CTCs水平，增加肿瘤转移风险。Wang等[34]研究130例Ⅱ～Ⅲ期CRC手术患者发现，术前CTCs计数明显低于术后3 d的CTCs计数，且在评估非转移性CRC手术患者的肿瘤复发存活率方面，术后CTCs优于术前CTCs。Yang等[35]研究138例行根治术CRC患者的无复发生存率，发现术后CTCs阳性是预后不良的独立指标，与术前CTCs阳性无关。另一研究表明，早中期CRC术后分良好预后组(术后CTCs＜3或术后CTCs数目比术前CTCs数目减少或持平)，反之则为不良预后组[28]。

3.4 CTCs用于指导治疗 CRC患者化疗的目的是清除残留在循环中的游离肿瘤细胞及微转移灶，传统的生物学监测与CTCs相结合将更有利于癌症的精确治疗，如用药的安全性、疗效、监测复发转移等方面。王丽丽等[36]将121例晚期CRC患者化疗后分为2组，肿瘤进展组81例与肿瘤控制组40例，肿瘤进展组CTCs阳性率比控制组高（87.5%vs 58.0%，P=0.001），证明CTCs计数与晚期CRC的化疗疗效相关，动态监测CTCs或可作为化疗效果早期评估的辅助性指标。另一试验也证明了化疗后CTCs阳性率与疗效呈负相关[33]。Sastre等[37]通过检测CTCs计数及KRAS来评估转移性结肠直肠癌患者接受贝伐珠单抗化疗后的效果，结果发现当CTCs＜3/7.5 mL时，KRAS野生型肿瘤的无进展生存期和总生存期均高于CTCs＞3/7.5 mL时，CTCs计数及KRAS是评估化疗效果的独立因素。Krebs等[38]研究得出CTCs分层计数可识别不同化疗方案中获益较多的患者，从而避免高毒性药物在低CTCs组中使用。Font-Clos等[39]通过建立类人型全身血液循环模型来模拟CTCs轨迹，该CTCs动力模型可模拟肿瘤细胞的转移扩散及黏附机制，同时结合影像学检查甚至可能确定肿瘤未来的转移部位，从而为肿瘤的转移治疗提供精确的指导。庞明辉等[40]检测88例结肠癌患者术前1 d及术后1、6、12月末外周血中的CTCs数量，发现肿瘤分化程度低、存在淋巴结转移的患者外周血中CTCs水平较高，术后12月末较1月末CTCs值升高的患者生存时间更短，肿瘤复发概率更高，因此动态监测CTCs水平的变化有利于肿瘤复发的早期判断、评估化疗效果，对术后短期内复发的Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期患者的治疗方案的选择有指导意义。

3.5 CTCs评估CRC患者长期预后 外周血中CTCs的存在是大多数癌症患者死亡的主要原因[41]。CTCs可以预测非转移性CRC的未来转移和不良的疾病结局，在转移性CRC中则可以预示着转移灶的重新播散[27]。曹霞等[28]研究发现可依赖术后CTCs数值或动态检测手术前后CTCs的变化预测早中期CRC的预后。任铁军等[42]使用CellSearch系统检测CRC晚期患者外周血7.5 mL，基线CTCs＜3的人群中位无进展生存期及总生存期均高于CTCs≥3的人群(P＜0.05)，其认为晚期CRC患者治疗前检测CTCs有一定的临床价值。Tsai等[32]利用微流控装置收集行CRC根治性手术患者的外周血7.5 mL，发现CTCs≥5个的患者一年内发生远处转移的概率是CTCs＜5个患者的8倍。另一项使用CellSearch系统的前瞻性研究也证明了每7.5 mL血液中CTCs＞1个的CRC患者预后较差[43]。汪栋等[44]应用密度梯度离心法和免疫荧光法检测69例Ⅱ～Ⅲ期CRC患者术前、术后3 d及术后14 d外周血中的CTCs，发现CRC患者术后3 d和术后14 d的CTCs阳性率与术后肿瘤复发相关，因此检测CRC患者围手术期外周血中CTCs数目有助于预后判断及肿瘤复发并提早干预。

综上所述，CTCs与癌细胞在基因表达方面具有高度的相似性，可以从不同方面反映肿瘤细胞的生物学特性，如肿瘤细胞的异质性、进化及突变等，对癌症的早期发现、诊断、鉴别具有重要意义。近年来，CTCs的检测技术被应用到胃肠道肿瘤的多个方面，评估预后、监控微小病灶及肿瘤的复发转移、监测反应/耐药、辅助确定精准治疗方案等。CTCs与传统的肿瘤活检有很好的一致性，检测外周血中CTCs使获取肿瘤标本更容易，并能对患者进行长期监测以跟踪病情[45]。但是现实中CTCs的检测还存在着诸多不足，尚无如何定义CTCs最低标准的共识，检测程序标准不统一，检验结果存在假阴性和假阳性，缺乏普遍化、灵活快捷、低成本的检验装置等。尽管如此，随着CTCs富集分析技术的进步，CTCs的重要性在胃肠癌患者的治疗和诊断中将会进一步得以体现。