线粒体通透性转换孔在神经退行性疾病中的作用研究进展

蔡 莹，孔凡丛，丁庆庆综述，杨 燕,2审校

线粒体是细胞中制造能量的结构，通过三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的形式提供能量，调节细胞内钙稳态和维持细胞内的氧化还原应激，从而在细胞存活中发挥重要作用[1]。在中枢神经系统(central nervous system，CNS)中，线粒体调节细胞存活和各种凋亡途径，对神经元的存活和死亡至关重要。线粒体结构为杆状(0.75～3 mm)，为真核细胞中双层膜包被的细胞器，其外膜和内膜包含磷脂和蛋白质。与线粒体外膜(outer membrane of mitochondria，OUM)相比，线粒体内膜(inner membrane of mitochondria,IMM)更复杂，折叠强度更大，大分子相对不易渗透。线粒体外膜(OUM)光滑，能渗透大量的营养物质、离子和能量分子(ATP和ADP)。IMM的不透水特性对于维持线粒体内环境的稳态以及线粒体的完整性至关重要。IMM中的不同离子通道和转运蛋白有助于线粒体与外部环境之间的通信。例如，钙(Ca2+)通过能量驱动的单向转运体从细胞质进入线粒体，而Ca2+从线粒体向细胞质的流出是由离子梯度驱动的反向转运体调节。氧化应激增加和能量代谢受损会损害Ca2+稳态，导致钙超载和错误转运。这种异常情况导致钙通过非选择性通道快速流出，最终导致mPTP的形成[2]。

1 mPTP的结构与功能

线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)由Hunter等人发现，是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种峰电导为～1.3 nS 的非选择性通道。通透性转换(permeability transition,PT)是指线粒体内膜(IMM)对分子量高达1.5 kDa的离子和溶质的通透性增加，导致线粒体基质肿胀，细胞通过凋亡(程序性细胞死亡)和坏死(非程序性自溶)而死亡[3]。直到最近，mPTP的结构仍存在争议，目前认为mPTP包括OMM中的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)、IMM中的腺嘌呤核苷酸转运子(adenine nucleotide translocator,ANT)和线粒体基质中的亲环素D(cyclophilin D,CypD)[4]。VDAC有助于线粒体外膜的通透性并与线粒体的苯二氮卓受体相关，因此它们调节线粒体外胆固醇向膜间隙的转移。ANT允许腺嘌呤核苷酸的磷酸化和非磷酸化衍生物通过IMM流入，CypD是线粒体通透性转换孔的关键组成部分，因具有肽丙异构酶活性而有助于蛋白质折叠，CypD也与神经退行性疾病相关[2]。

在正常生理条件下，mPTP的所有成分都被解聚；而在凋亡或应激刺激下这些成分会结合形成1.0～1.3 nm的孔隙，触发分子的非选择性通量。鉴于mPTP形成的机制基础，研究人员提出mPTP的形成是由IMM中的ANT与CypD的结合引发的，其中CypD从线粒体基质转移至IMM。这种结合促进了由ANT和VDAC组成的隧道样结构的形成，并通过跨越两个线粒体膜将线粒体基质与胞质连接起来。 mPTP的形成不仅是细胞死亡的关键事件，还对线粒体的功能和细胞发育非常重要[5,6]。使用钙超载模型，发现mPTP开放需要组装ATP酶(C-亚基)、无机多磷酸盐(polyP)和聚羟基丁酸酯(PHB)[7]。

除了以上成分，F1F0-ATP合成酶是mPTP孔型结构的组成成分，也参与mPTP开放。Bonora等使用遗传方法表明F1F0 ATP合成酶二聚体的解离和C环的参与在mPTP诱导中至关重要[8]。Baev等利用光散射，荧光和电子显微镜技术，发现钙诱导的PTP在低渗溶液中被显著抑制[9]。使用基于RNAi的筛选方法，Shanmughapriya等证实了痉挛性截瘫7(spastic paraplegia 7，SPG7)在Ca2+和ROS诱导的PTP开放中的必要性作用,并提出SPG7是构成PTP复合体并调节其功能的保守核心组成部分[10]。关于VDAC和ANT参与mPTP形成的研究报道尚存在差异，这提示还存在可促进mPTP形成的其他重要分子成分，但CypD被认为在mPTP的组成中至关重要。 mPTP开放与各种神经退行性疾病有关，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)、朊病毒病 (prion disease)、运动神经元病(motor neuron disease,MND)，亨廷顿舞蹈症(Huntington disease,HD)、脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)和肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)[1]。mPTP开放的特征在于整个IMM的电化学势能的解耦联和线粒体渗透性的紊乱，伴随着Ca2+的错误转运和线粒体中ATP生成减少。当mPTP开放时，通过凋亡途径发生细胞死亡，这会导致氧化磷酸化和ATP水解的机制减少。在此过程中，充足的ATP和mPTP的瞬时开放导致细胞色素C通过线粒体释放，其激活半胱天冬酶级联反应和线粒体驱动的细胞凋亡。与细胞凋亡相反，持续和广泛的mPTP开放通过介导氧化磷酸化的解偶联来限制ATP合成。随着高能量需求的开始和ATP产生的减少，细胞团失去其结构和功能完整性，导致不可逆的损伤和细胞死亡[11]。

2 mPTP在不同神经退行性疾病中的作用

2.1 AD和mPTP 阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，其特征在于认知功能逐渐下降和神经元不可逆转的丧失。AD是老年期最常见的痴呆类型，是随后导致死亡的主要原因。AD脑的病理特征在于β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的神经炎性斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(NFTs)。神经炎性斑和神经原纤维病变均可导致受累脑区神经元的丢失[12]。mPTP的开放可能与在AD脑中观察到的线粒体功能障碍有关，mPTP在AD的代谢应激中起作用。Bonora M等发现来自AD患者和AD动物模型的脑线粒体中CypD表达增加[13]。在淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)过表达的转基因AD小鼠模型中，CypD蛋白的基因去除可防止线粒体功能障碍，并改善突触和认知功能丧失，而且从CyPD基因敲除小鼠中获得的神经元显示出Aβ依赖性活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生减少，钙缓冲能力增加，线粒体呼吸功能改善以及AD中突触可塑性异常的减弱[1]。在对AD患者外周组织线粒体功能障碍的研究中，Maria Jose Perez等研究发现AD患者皮肤成纤维细胞表现出与AD病理影响的神经元相似的线粒体损伤迹象，AD成纤维细胞有线粒体钙调节障碍，并显示出非特异性线粒体钙通道的持续激活，即mPTP。使用环孢素A (Ciclosporin A,CsA)药物阻断mPTP的作用可以阻止AD成纤维细胞线粒体超氧化物水平的增加，改善AD成纤维细胞线粒体和胞质钙的失调[14]。

神经毒性聚集体的沉积是由毒性肽的过量产生和清除机制的功能障碍介导的。这些聚集体会诱发神经元的功能障碍，导致认知和记忆障碍，而且自由基生成和钙平衡失调会增加聚集体的神经毒性作用。Aβ的存在已在人AD脑和转基因(Tg)AD动物模型的线粒体中得到证实[15]。关于线粒体中的Aβ是原位产生还是输入的尚有争议，Picone P等提出Aβ来源于细胞外和细胞内池，然后在线粒体中内化[16]。Aβ和CypD之间的相互作用导致mPTP的形成，线粒体电位降低、线粒体呼吸功能降低、自由基形成增加、导致氧化应激和促凋亡蛋白的释放。鉴于AD的病理生理级联反应起始于mPTP形成，针对mPTP的治疗性干预可能有助于逆转该疾病病理。目前，mPTP已作为神经退行性疾病的潜在药物靶点广泛研究。

2.2 PD和mPTP 帕金森病(PD)目前影响全球约630万人，预计到2030年将影响800万～900万人。它主要通过黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNPc)中多巴胺能神经元的丧失和突触前神经元细胞中过量α-突触核蛋白的存在来影响运动神经元，该疾病的主要临床表现有静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍。细胞氧化还原状态受损、代谢缺陷和线粒体功能障碍在PD中有报道，Ca2+稳态、α-突触核蛋白聚集体的丧失、线粒体呼吸复合物I缺陷和线粒体自噬也与PD有关[17]。与AD相似，PD通过线粒体功能障碍以相同的方式形成mPTP，包括一系列事件：IMM去极化、受损的氧化磷酸化、ROS产生增加、线粒体基质肿胀、IMM嵴去折叠、Ca2+稳态丧失、以及通过OMM释放凋亡蛋白，最终导致细胞死亡。Ludtmann MHR等研究发现LRRK2的缺失、抑制和突变能导致通过Na+/Ca2+/ Li+交换体(NCLX)进行的的线粒体Ca2+排出受损，进而降低线粒体通透性转换孔(PTP)的开放阈值并增加细胞死亡。NCLX活性可以通过直接(拟磷酸NCLX突变体)和间接(蛋白激酶A)激活来恢复，反过来提高了PTP开放阈值。这可能为PD的治疗提供一种新的策略[18]。

2.3 HD和mPTP 亨廷顿舞蹈病(Huntington disease,HD)是一种遗传性常染色体显性遗传病，神经元代谢和能量处理的缺陷是HD脑的主要特征。其临床表现为进行性运动功能障碍和精神障碍，并伴有痴呆。HD是由于亨廷顿基因(Htt)CAG重复序列的异常扩增导致亨廷顿蛋白质(mHtt)中聚谷氨酰胺的病理延长，进一步损害脑细胞所致。目前Htt在细胞中以及病理机制中的作用尚不明确。越来越多的证据表明线粒体损伤参与了该病的发病机制和进展。 在细胞和鼠类HD模型中，多个研究发现了线粒体紊乱，包括钙处理缺陷、去极化、线粒体运输能力下降、ATP产生减少以及活性氧(ROS)增多。系统分析表明，线粒体通透性转换孔(mPTP)可能是影响线粒体的这些变化的原因。阻断mPTP活性不仅可以预防整体的线粒体缺陷，还可以逆转Htt引起的脑病变。因此，进一步了解Htt是否通过mPTP直接或间接影响线粒体功能，对于确定HD的病理进展和发现新的治疗靶点具有重要意义[1,19]。

3 mPTP是一种潜在的药物靶点

不可逆的mPTP形成与各种神经退行性疾病有关，制定药理学和遗传学干预措施抑制mPTP的形成为治疗神经退行性疾病提供了方向。

目前认为，在所有参与mPTP形成的组分中，CypD发挥关键作用。在阿尔茨海默病(AD)中，线粒体功能障碍是诱发突触损伤和神经应激的关键。AD患者的线粒体表现出呼吸功能、能量代谢和线粒体形态的改变[20,21]。与非AD脑的线粒体相比，从AD患者大脑皮质和海马区分离的线粒体中CypD的表达显著增加。Du H等研究发现CypD表达增加与Aβ表达增加呈正相关，二者具有结合亲和力，而且具有序列特异性。表达APP突变的AD小鼠模型与其同窝对照组相比，也表现出大脑皮质和海马区CypD表达增加[15]。有研究使用mAPP模型建立mPTP形成过程中发生的各种事件，包括使皮质线粒体中IMM的CypD表达增加、Ca2+稳态改变和线粒体肿胀，并进行了消融CypD以防止mPTP形成的研究[2]，使用CypD抑制剂环孢菌素A消除CypD也可以减轻这些不利影响[14]。

线粒体F1Fo ATP合酶失调是一种典型的线粒体缺陷，导致该疾病中氧化磷酸化的失败。寡霉素敏感性相关蛋白(Oligomycin sensitivity conferring protein,OSCP)是至关重要的F1Fo ATP合酶亚基。OSCP水平降低以及OSCP与β淀粉样蛋白(Aβ)的相互作用构成了AD相关疾病中F1Fo ATP合酶病理的关键方面。目前促进这种与AD相关的OSCP变化的详细机制尚未阐明。Gauba E等在AD患者以及AD小鼠模型中发现，CypD可能是AD相关疾病中介导OSCP缺陷的关键媒介，AD小鼠模型中CypD缺失可以使OSCP的改变减少，F1Fo ATP合酶功能得以保留，线粒体生物能量学得以恢复以及小鼠的认知能力得到改善。AD治疗中线粒体功能障碍的一种治疗策略[22]。Thomas B等采用神经毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6 -四氢吡啶)制备的急性PD小鼠模型模型中，与对照组小鼠相比，CypD基因敲除(Ppif-/-)组显示出明显的细胞保护作用[23]。在急性大脑中动脉闭塞和再灌注后，CypD缺陷小鼠的脑梗死面积也显著减少，有力地支持了CypD在钙超载和氧化应激受到影响的缺血性损伤模型中具有重要作用。同样，在体外研究中，CypD在线粒体通透性转换(CyD-mPT)中的重要作用在谷氨酸引发的延迟钙失调(delayed calcium deregulation,DCD)和兴奋毒性细胞死亡中得到验证。与对照小鼠相比，来自Ppif-/-小鼠的皮质神经元对DCD和细胞死亡更耐受。

以上研究均表明CypD是预防慢性神经退行性疾病进展的强有力的作用靶点。为了确定mPTP形成在神经退行性疾病进展中的作用，临床研究主要使用CypD抑制剂环孢菌素。但是环孢菌素作为研究CypD抑制和线粒体功能障碍的临床工具具有一定的局限性，主要包括其毒性和免疫抑制作用，其他方面包括组织穿透力和血脑屏障的穿透力低等[1]。Warne J等设计并合成了一种新的线粒体靶向CypD抑制剂JW47，其使用喹诺盐阳离子与环孢霉素结合。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中发现，JW47表现出对轴突的显著保护作用，并通过最少的免疫抑制改善了运动评估[24]。Ahmed-Belkacem等人利用基于核磁共振(NMR)和X射线晶体学等方法生成了一种新的非肽类小分子亲环素抑制剂家族，与CsA无关，具有很强的体外PPIase抑制活性[25]。Elkamhawy A等测定了28种新型吡嗪基脲对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的mPTP开放的对抗作用，其中17种化合物对Aβ诱导的mPTP开放的神经保护作用优于CsA。其中1-[3-(苄氧基)(吡嗪-2-基)-3-(3,4-二氯苯基)脲(5)]、1-[3-(benzyloxy)(pyrazin-2-yl)-3-(3,4- dichlorophenyl)urea (5)]在ATP测定和MTT测定中有效地维持了线粒体功能和细胞活力[26]。

今后，多种药理学方法的使用将通过增加候选分子的药物样特性和生物活性来促进新药物的开发，例如增强线粒体生物发生、抑制过量的线粒体ROS产生和mPTP开放。候选药物分子可以通过最佳拟合合成，半合成和微生物分子的虚拟筛选及其化学转化得到新型活性类似物，并使用计算机模拟定量结构活性关系(quantitative structure-activity relationships,QSAR)建模、分子对接、吸收、分布、代谢、排泄和毒性研究，以设计出具有更高生物利用度、更低毒性、穿过血脑屏障及其他特性的药物。

4 小 结

综上所述，线粒体功能障碍和mPTP形成在介导神经退行性疾病中具有重要作用。尽管与神经退行性疾病相关的mPTP形成的结构和机制基础尚未明确阐明，但用mPTP抑制剂获得的结果表明其作为治疗各种神经退行性疾病的潜在靶点具有良好前景。利用QSAR建模等优化技术进行药物开发也有助于筛选虚拟模拟物及其药物样潜能。