帕金森病的非人灵长类动物模型研究进展

宋净洋 车祥源 邢红霞

1.新乡医学院第一附属医院神经内科，河南卫辉 453100；2.新乡医学院第三附属医院神经内科，河南新乡 453000

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人群中常见的神经退行性疾病［1］，以中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元退行性变性死亡以及路易小体的形成为主要病理生理特征。PD 的发病机制目前尚未阐明，可能与环境、遗传、线粒体功能障碍、氧化应激、免疫异常、细胞凋亡等诸多因素有关。目前PD的治疗主要以改善症状的药物治疗为主，但仍然缺乏有效的根治措施，到了疾病晚期阶段，患者往往生活难以自理，因此给PD 患者其所在的家庭及社会都带来沉重的负担。要进行PD 疾病的研究，通常需要构建理想的PD 动物模型。啮齿类动物与人的差异较大，而非人灵长类（non-human primates，NHPs）的行为能力和神经解剖学复杂性非常类似于人类，因此NHPs的使用无疑是研究PD 的关键工具。因此笔者主要针对PD 的NHPs 动物模型做一介绍。

1 现有PD 动物模型

PD 的研究过程中有两个主要困难：一是缺乏完整的参与神经退行性过程的分子机制，二是缺乏拥有充分的可进行方法评估的预测模型。第一个困难可以通过在众多类型PD 动物模型中研究得出。而第二个困难目前尚未解决。目前通过基因改造和神经毒素的干预产生的PD 动物模型并没有产生在行为和病理结果上均可预测的PD 动物模型。

最近，通过将外源基因引入NHPs 基因组或改变NHPs 的内源基因，产生了几种NHPs 转基因动物模型［2］。虽然NHPs 转基因动物模型有助于了解PD 的发病机制，但是由于NHPs 与啮齿类动物比较寿命长，因此对NHPs 的PD 模型发病机制的研究需要很长的时间。而当前可用的遗传模型也不能完全诱导出具有明显神经退行性变的PD 表型［3］，神经毒性模型则可以通过破坏黑质纹状体通路诱导出具有明显神经退行性变的PD 表型［4］。NHPs 动物模型是一种公认的PD 模型，现在研究大多通过使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）和6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导黑质纹状体神经元选择性变性诱导PD 模型［5］，这些模型可以通过神经毒素的全身或局部给药来发挥作用［6］。

2 NHPs 中经典PD 动物模型

2.1 NHPs 中MPTP 诱导PD 动物模型

MPTP 是高度亲脂性化合物，它可以快速穿过血脑屏障。MPTP 毒性的潜在机制是单胺氧化酶B 将MPTP 转化为阳离子MPP+，该阳离子可通过黑质致密部进入DA 能神经元。MPP+主要通过阻断线粒体复合体Ⅰ的活性导致ATP 消耗和氧化应激增加［7］，从而诱导PD 模型。但采用MPTP 诱导的急性神经毒性模型无法复制出与PD 路易小体相似的的蛋白质聚集体，即使长期、大剂量的MPTP 诱导的灵长类PD 动物模型也无法复制出α-突触核蛋白聚集的病理现象［8-9］。

与其他可用的PD 模型比较，MPTP 模型不需要熟练的立体定位技术，其在生化、解剖学和行为学方面与人类PD 症状具有较大的相似性。但与6-OHDA模型比较，在首次注射MPTP 后的24 h 内MPTP 模型可出现因为心脏毒性而引起的剂量依赖性死亡［10］。此外，尽管MPTP 本身并不直接有害，但其代谢产物MPP+具有剧毒，所以采用MPTP 处理动物模型时对处理动物的人员有严重的安全隐患［11］，所以需要具有严格安全设备的实验室。

2.2 NHPs 中6-OHDA 诱导PD 动物模型

6-OHDA 是一种儿茶酚胺能神经毒素，广泛用于诱导啮齿动物和NHPs 动物中DA 能神经元的死亡［12］。6-OHDA 不能透过血脑屏障，所以需要将6-OHDA立体定位直接注入到目标大脑区域。儿茶酚胺能神经元可以通过单胺转运蛋白选择性吸收6-OHDA，通过增加活性氧的产生诱导交感神经元的丢失，破坏能量代谢和神经元的活动从而诱导PD 模型［13］。

在NHPs 动物中，将6-OHDA 注入到黑质纹状体束或纹状体内会导致典型的帕金森样运动缺陷，这与黑质区酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞的丢失有关。除了将6-OHDA 立体定位直接注入到目标大脑区域外，也可以全身给药以模拟心脏自主神经功能失调状态［14］。静脉注射6-OHDA 会引起心脏儿茶酚胺能神经支配的丧失和循环儿茶酚胺水平的降低［15］，但在6-OHDA 模型中仍然没有观察到路易小体或α-突触核蛋白的聚集体。

3 NHPs 中新型PD 动物模型

经典的PD 动物模型（6-OHDA 和MPTP 模型）虽然能够模拟人类PD 的病理生化改变，但不能模拟PD 主要的病理生理特征，即细胞内路易小体的形成。而α-突触核蛋白是形成路易小体的重要成分，其主要由清理毒性蛋白的泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）降解［16］。因此McNaught 等［17］构建出一种基于抑制UPS 的PD 模型：经PSI 系统（可逆性合成小肽的蛋白酶抑制因子）处理的大鼠在饲养中出现以下症状：活动减少、僵直、姿势异常、震颤等的帕金森综合征表现，并出现了与PD 相同的神经病理学特征：黑质中TH 阳性DA 神经元细胞的丢失，纹状体DA 耗竭，α-突触核蛋白和泛素在蓝斑、迷走神经背核等的聚集积累。PSI 诱导出的模型和现有使用UPS 抑制剂乳胞素［18］实验结果相一致。许多研究者使用UPS 抑制剂对啮齿类动物和灵长类进行全身系统的注射［19］，却没有复制出PD 模型［20］，该系统模型构建的失败可能与一系列因素，如药物剂量、吸收的因素、药物暴露时间、通过血脑屏障的通道、所用溶剂等相关。然而，在黑质纹状体内直接注射UPS 抑制剂产生的初步效果与Lillethorup 等［21］描述的相一致。注射乳胞素到鱼的脑脊液中构建的模型，也出现蛋白聚集体、DA 神经元的丢失等病理特征［22］。研究者在啮齿类动物中的研究显示TH 阳性的神经元细胞的丢失数量表现出乳胞素-剂量依赖性。这提示，利用脑内UPS 抑制体系的作用可以构建一个与之一致并可重复的模型［23］。

利用UPS 抑制剂建立的模型能够完整地展现出：PD 的运动和非运动临床特征，TH 阳性神经元细胞的丢失，黑质区炎症标志物的增多，内含α-突触核蛋白和泛素的包涵体的聚集积累等病理特点。因此构建出蛋白酶体功能障碍的NHPs 模型将对探究出PD的发病机制、疾病防治、临床药物有效性和安全性评价具有独特的优势。

4 NHPs 中PD 动物模型评估

4.1 行为学观察

为了更好地研究PD，需要建立可以高度复制的PD 动物模型，以解决包括大脑病理变化在内的所有与PD 相关的问题。首先，可以使用临床评分量表记录典型的PD 症状（如正常、肌肉僵硬等）及异常的非自主运动症状（如面部及全身行为等）。这些临床评分可以通过双盲方式观看动物的事后视频记录，记录患病动物的自发运动能力来进行。

4.2 正电子发射断层扫描（PET）

PET 成像是一种相对非侵入性的神经成像技术，可用于阐明与PD 相关的功能改变，并通过评价黑质纹状体DA 系统的完整性来提供诊断信息［24-26］。在异氟醚麻醉下，NHPs 可进行PET 扫描，使用包括18FDOPA、18F-FP-CIT、11C-FP-CIT、11C-CFT、11C-PE2I、18F-AV-133、11C-DTBZ 等在内的正电子发射同位素标记的示踪化合物，可以对体内的生化过程进行成像和测量［27-28］。

4.3 磁共振成像（MRI）

功能性和结构性脑成像的快速发展使得观察脑功能的特定变化成为可能。MRI 比PET 应用广泛得多，是在体内对整个大脑进行解剖成像最常用的系统。它可以非侵入性获取PD 引起病变的功能性图像［29］。NHPs 是进行PD 研究的最合适的物种，目前已越来越多地通过MRI 进行研究。MR 光谱也可以用作非侵入性工具，通过测量某些代谢物的存在和浓度来评估与神经变性和抗PD 治疗相关的体内动态变化［30］。

4.4 病理学检测

虽然对黑质纹状体系统的评价是PD 研究的基本工具，但病理学检测也很重要。我们建议在戊巴比妥深度麻醉下，行心内灌注肝素化盐水，然后取出大脑，固定后进行形态学处理。猴脑的大小（与大鼠或小鼠比较）具有以下优点：新鲜器官可以切片，确定区域，并且可以采集特定目标区域的小组织样本。也可以通过电化学检测功能的高效液相色谱法（HPLC）检测新鲜脑样本、脑脊液或通过体内微透析获得细胞外液中的DA 和DA 代谢产物3，4-二羟苯酰乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的量［31］。此外，还可以通过免疫组织化学方法来测定黑质DA 能神经元的数目。

5 结论

尽管动物模型可能无法充分反映人类疾病的特征，但它们可用于分析疾病的某些方面，而使用简单的体外模型无法对其进行全面研究。人们对NHPs 动物模型的兴趣逐渐增加，因为它们是唯一在临床试验前进行临床前评估时与人类具有高度相似性的相关物种。所以，在临床前阶段，将NHPs 用作实验模型具有许多显著的优势。本文通过对PD 的NHPs 动物模型的介绍，可以帮助研究人员根据研究的特定目的选择合适的造模方法。在PD 的NHPs 动物模型中进行的研究可能有助于开发用于早期诊断的工具，还有可能帮助开发旨在阻止或减慢疾病进展的下一代PD药物。