熊胆粉产业化关键技术研究

闫广利，孙晖，邱丽萍，靳喆，吴修红，李杏花，杨波，王喜军*

(1.黑龙江中医药大学 国家中医方证代谢组学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150040；2.福建归真堂药业股份有限公司，福建 泉州 362100；3.黑龙江黑宝药业股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150040)

熊胆是我国传统名贵中药材，为脊索动物门哺乳纲熊科黑熊SelenaretosthibetanusCuvier或棕熊Ursus-arctosLinnaeus的干燥胆囊(胆汁)，具有清热、镇静、明目、杀虫的功能[1]。熊胆传统通过“杀熊取胆”的方式获得，现代已开发了多种活熊胆汁引流技术，收集黑熊的胆汁加工制成熊胆粉，已获批国家一类中药新药，其单味制剂熊胆胶囊收载于《中国药典》[2]，并作为原料药应用于万应锭、比拜克胶囊、风热清口服液、龙泽熊胆胶囊、复方熊胆滴眼液、熊胆救心丸、熊胆痔灵栓、消痔软膏、梅花点舌丸、麝香通心滴丸等《中国药典》收载的成方制剂中。现代研究发现，熊胆粉在肝胆系统、心血管系统、呼吸系统、中枢神经系统、眼科、肛肠科等疾病中具有显著的临床疗效，其中除肝胆系统疾病外，熊胆粉的其他疗效并非是其主要成分牛磺熊去氧胆酸等产生的[3]；笔者研究发现，熊胆粉清热解毒保肝等作用是其中除掉熊去氧胆酸等小分子胆酸类成分后的大分子蛋白类成分所特有，而且具有高效的抗丙型肝炎病毒作用(IC50<0.2 μg/mL)，这是其他中药或动物胆汁及牛磺熊去氧胆酸等人工合成品所不能替代的[4-7]。熊胆粉广泛的临床需求和不可替代的特有药用价值，决定了熊胆粉产业化的巨大经济和社会效益。本文对影响熊胆粉生产的关键技术进行综述，以期促进熊胆粉的产业化发展。

1 黑熊养殖技术的发展

黑熊养殖是保障熊胆粉可持续生产的前提。我国传统中药熊胆主要通过“猎熊取胆”的方式获得，对野外种群造成很大威胁，开展黑熊养殖技术研究，不仅保障传统中医药产业的可持续发展，同时也更好地保护了熊类野外种群。

我国黑熊养殖业始于上世纪80年代，此时主要依靠从野外捕捉或从动物园引入，在饲养场进行驯化和饲养，抽取胆汁时熊要被固定上一个“铁背心”，用一根胶管插入熊的胆囊，随用随取。而且当时饲养场设施简陋，饲养人员专业知识缺乏，熊的福利状态极差。这种最初的黑熊养殖及残忍的取胆方式引起了动物保护组织及公众的抗议，对现在普遍采用的“无管自体造瘘胆汁引流技术”的黑熊养殖业产生巨大负面影响[8-9]。

养殖场中黑熊福利问题是一个感情和伦理范畴的题目，是动物保护组织和公众关注的焦点问题。我国政府不断规范黑熊养殖业，促进解决人工养殖黑熊的福利问题。林业部于1997年发布了《黑熊养殖利用技术管理暂行规定》，2008年颁布了林业行业标准《黑熊养殖技术规程》，2017年又颁布了林业行业标准《黑熊繁育利用技术规范》，这些国家法规和标准引导、规范了养熊业，逐步淘汰了规模小、条件简陋、专业人员缺乏、卫生状况差、不能成功繁殖的养熊场，保障了人工养殖黑熊的福利条件，使黑熊养殖业逐步走向规范化、规模化、可持续的发展之路[10]。

在国家法规和国际公约的引导下，黑熊养殖企业不断加强养殖技术的开发和规范操作规程，示范性引领了行业的发展。黑龙江黑宝药业养熊场逐步探索建立了黑熊养殖的标准化操作规程，形成了一套完整的从饲养管理、疫病防治、疫情控制、档案管理、饲料配制、仔熊哺育和熊胆粉精制加工等方面的科学的饲养管理体系，目前拥有黑熊3 000余头。黑宝药业养熊场以“本交”繁殖与人工繁育相结合，解决了在提高胎产率、成活率以及孕检技术等方面的问题，同时在人工采精、授精、仔熊哺育和孕检技术等方面取得突破性进展，每年出生幼熊成活率达100%，为熊科动物二代及后代的人工繁殖打下了坚实的基础。自1999年已有第三代饲养熊诞生并存活，目前圈养条件下繁殖的熊数量已是圈养熊的主体，其中子Ⅰ代387头，子Ⅱ代901头，子Ⅲ代及后代2 264头。根据《濒危野生动植物种国际贸易公约》规定，野生动物人工繁育进入子Ⅱ代或后续子代应当被视为驯养动物，其交易不被禁止，即可用于人类生活。目前黑宝养熊场的黑熊人工繁育已进入子Ⅴ代，年人工繁育数量超过500头，可合法交易使用。

福建归真堂药业拥有我国南部最大的黑熊驯繁基地，根据黑熊年龄、发育状况，配制不同的营养食谱方，建立了黑熊繁育、饲喂配方、疾病防控、引流胆汁等方面的操作规范，承担起草了国家林业行业标准“养熊场符合性规范”、福建地方标准“黑熊养殖及活熊取胆技术规程”，使黑熊驯养繁殖符合法律法规、达到相关标准的要求。归真堂药业现养殖黑熊1 000余头，其中子Ⅰ代441头，子Ⅱ代531头，子Ⅲ代及后代40头，每年可繁殖小熊150～200头，出生幼熊成活率达100%。

黑熊养殖的产业化，不仅解决了熊胆粉的资源问题，更起到了保护野生黑熊免于猎杀的作用，从源头上满足了人类对于野生动物的食用及药用等需求。正由于此，目前野生黑熊的数量在逐年大幅度提升。

2 熊胆汁引流技术

熊胆传统的制备方法是杀熊取胆，致使药源动物濒于灭绝。20世纪80年代后期，国内逐步应用活熊胆囊插入引流管采集胆汁，即有管胆汁引流采集技术，来生产熊胆粉[11-12]。这种方法在胆囊内存有常在性引流管，造成胆囊与肝脏的损伤和感染，对熊的健康和寿命造成严重影响，也影响熊胆粉的质量[13-14]。而且，这种有管胆汁引流方法需要给熊穿戴“铁背心”，熊在采集胆汁过程中极为痛苦，由此造成动物保护组织对养熊取胆的激烈抗议。然而，这种有管胆汁引流技术很快就被新的自体造瘘无管胆汁引流技术所取代。

国家林业局《黑熊养殖利用技术管理暂行规定》要求“不得采用常流式或异物引流导管，须用熊自体组织作引流导管，取胆熊体不得加装任何附加装置”。熊自体造瘘无管胆汁引流技术符合国家规定，是通过外科手术在胆囊切开创口，与自体组织形成瘘管，瘘口固定于腹外，可用于每日非连续、定时定量进行采集。经无管引流取胆的熊不必穿“铁背心”固定，熊活动自如，自由饮食，而且避免异物存留造成胆囊炎的发生，同时提高胆汁质量和产量。

目前，国内大型养熊场已普遍掌握黑熊自体造瘘无管胆汁引流技术。黑龙江黑宝药业与福建归真堂药业从不同角度完善了黑熊自体造瘘无管胆汁引流技术[15]。即：成年黑熊在完成术部清洗、除毛、消毒后，于腹中线剑突向下处，切开皮下组织，钝性分离肌肉，切开肌膜、腹膜，把胆囊缓慢拉出，在胆囊上切开创口，并与肌肉组织形成瘘管，用缝合线适度扎紧再固定胆囊和胆囊皮肤，分别缝合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮肤，然后清洗和消毒术口，并与术苏醒后4 h，给予黑熊饲喂蜂蜜水或糖水和鸡蛋水；术后一周内，给予黑熊肌注或口服抗生素，防止创口感染，并注意定量饲喂合理搭配的营养饲料。痊愈后每日定时采集熊胆汁。该项无管无痛自体造瘘胆汁引流技术，实现了在自然生活状态下取胆，每天150 mL的胆汁引流量(分泌量1 200 mL以上)，既保证了熊的自身生理需求和身体健康，又保证了熊胆粉的质量稳定。

熊自体造瘘无管胆汁引流技术的关键环节是自体造瘘方式和胆汁收集方式，前者会影响术后溢漏胆汁、引流导管狭窄或闭锁，后者会影响真正无痛取胆的效果。延边松宝制药有限公司建立了一种熊自体组织引流导管及人工纵型皱褶取胆汁的制作方法[16]，即利用熊空肠或胆囊组织作引流导管，吻合或连结导管与胆囊并理顺，做皮外引流口，制成熊自体组织引流导管。期间，熊开腹后在胆底部采用缝合或打结法造纵型皱褶3～6个，皱褶均匀，闭合严密，解决了术后溢漏胆汁的难题，并且便于插管取胆，不伴发引流口、引流导管狭窄或闭锁，抗感染的免疫力和修复能力强。采集胆汁时，将已消毒好的软导管对准先用酒精消毒的引流口，经引流道插入胆囊内，胆汁靠重力自然流出于接胆瓶内。软导管与金属导管不同，不引起胆囊炎和胆囊出血，避免偶有伴发疼痛的弊病[17]。云南天佑熊业制药有限公司建立了一种利用能够调节瘘管括约肌收张而方便收集胆汁的方法，即在黑熊的腹壁和胆囊之间，利用黑熊自身组织在腹壁端制造环形括约肌，括约肌收缩时能关闭管腔，舒张时使管腔开放，利用括约肌受植物性神经的支配或激素调节的特性，采胆时给黑熊喂营养液，使黑熊括约肌舒张，管腔开放，用酒精棉球消毒开放的管腔通道口，把消毒后的空心探针探入管腔通道，胆汁即沿着空心探针自动流到接胆汁的杯子中，取胆完成后即可拔出探针[18]。

熊自体造瘘无管胆汁引流技术完全摆脱了笼养、铁背心、留存管等对黑熊身心残害的生产方式，已实现标准化及产业化。目前人工养殖黑熊无管引流取胆每头黑熊每年可产3 kg熊胆粉，而据调查获取1 kg熊胆粉需要猎杀22～25头熊，那么饲养一头黑熊相当于一年保护66～75头黑熊免于杀害[9]，因此，该技术有力解决了熊胆使用和野生动物资源保护之间的矛盾。

3 引流取胆对黑熊健康影响的评价

熊自体造瘘无管胆汁引流技术极大地改善了人工养殖黑熊的福利问题，使熊胆的可持续使用成为可能，但长期引流取胆汁是否对养殖黑熊的健康造成影响，仍是社会尤其是动物保护组织关注的焦点，也是养熊业能否成为可持续发展行业的关键。

动物行为是指动物在一定环境条件下，为了完成摄食排遗、体温调节、生存繁殖及满足其他生理需求而以一定姿势完成的一系列动作，具有明显的环境适应机能。东北林业大学对福建归真堂黑熊养殖基地的24头圈养黑熊昼间行为进行了细致的调查，包括休息、饮水、排遗、运动、警戒、体表护理、社群、繁殖、刻板及其他类等10类行为，统计分析了不同季节、不同年龄段、不同性别取胆与非取胆黑熊昼间行为的影响，结果发现：冬季时对刻板行为、休息行为、体表护理行为有影响，春季时对繁殖行为有影响；4～6岁取胆对黑熊排遗行为、体表护理行为、刻板行为、社群行为有影响，7～9岁时对黑熊排遗行为和体表护理行有影响；取胆对雌性黑熊社群行为有影响，对雄性黒熊排遗行为有影响[19]；除此之外，取胆对黑熊昼间行为均无影响。该研究指导了熊类养殖向更科学、合理的方向发展，养殖场据此研究完善了圈养黑熊的养殖化管理，在动物室的笼舍内增设供黑熊玩乐的设施，比如钢筋爬梯，以达到丰容的目的，通过增加玩耍行为来减少刻板行为的发生；在笼舍内增设躲避设施，降低特殊时期人为干扰给黑熊带来的必理压为；除特殊情况(待产雌性黑熊和产仔雌性黑熊)外，其他黑熊尽量不单笼饲养，并且有严重刻板行为的黑熊不和其他无刻板行为或者有轻微刻板行为的黑熊同笼饲养，以减少模仿；在早晚两次定时饲喂的中间，不定时地少量投喂一些蔬菜、水果，降低定时饲喂模式对刻板行为的影响；按顺序每天安排一批熊进入活动区域活动，广阔的活动空间减少了黑熊刻板行为的发生。通过完善的养殖化管理，养殖黑熊的种群和种质得到保护。

笔者课题组从行为学、生理学、生物化学及系统生物学等角度对黑龙江黑宝药业养殖场黑熊的健康状况进行了系统研究，评价了长期引流取胆汁对黑熊健康状态的影响。首先采用行为学研究的方法，观察并分析了养殖熊的各阶段行为特点，从整体上初步对人工养殖熊包括引流取胆汁熊的生活质量及状态做以分析，证明了引流取胆汁黑熊与正常养殖黑熊行为无差异；又进一步再通过对肝功能(ALT、AST等15项指标)、肾功能(UN、Cr、UA、CO2CP共4项)、胰功能(AMY)、血脂与脂蛋白(CHO、TG等6项指标)、血糖(GLU)、心肌酶(CK、CK-MB、LDH、HBDH共4项)、电解质(P、Mg等8项指标)、尿液及粪便(SG、UBG等26项)等所包括的65项指标比较测定，客观地评价机体的各系统及器官的功能状况，未发现引流取胆汁熊各相关的器官及系统与非取胆熊有明显差异(P<0.05)；在此基础上，又采用代谢组学的方法，从整体代谢上全面地评价引流取胆汁对正常养殖黑熊机体功能的影响，证实引流取胆汁对黑熊血液及尿液代谢物无影响。通过三方面的系统研究，未发现长期引流胆汁对黑熊的行为、各系统功能及代谢水平产生影响，阐释了“无管无痛自体造瘘胆汁引流技术”的可行性[20]。

4 熊胆粉加工技术

引流采集的熊胆汁需要进一步处理、加工制成熊胆粉，加工工艺主要包括澄清、除杂、干燥三个步骤。首先，熊胆汁在4～10 ℃静置澄清；然后，采用离心、过滤或大孔吸附树脂等方法进行吸附处理，得到水溶性熊胆汁；最后，采用真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等方法，制备获得熊胆粉[15]。例如，熊胆汁在10 ℃静置24 h，静置后的上清液采用10 000 r/min的高速离心机进行离心处理45 min，离心液即水溶性熊胆汁，再置于真空干燥机中，在60 ℃、相对压力为-0.06 MPa下，真空干燥48 h后，进行粉碎，过120目筛，即得到含水率2%的熊胆粉成品，为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末；取熊胆汁静置后的上清液，于相对压力0.1 MPa下通过过滤精度为0.5 μm的钛板钛棒过滤器进行过滤，滤液采用浸膏喷雾干燥机，在射流速度990 m/s，30 ℃、相对压力-0.06 MPa下，以超音速速度瞬时干燥，然后粉碎，过120目筛，即得含水率2%的熊胆粉成品，为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末；取熊胆汁静置后的上清液，按重量比为1∶80的比例与D101型工业大孔吸附树脂混合均匀，用水洗涤至大孔树脂流出液无胆汁颜色，所得流出液于压盖型冷冻干燥机中进行程序升温冷冻干燥，粉碎后过100目筛，即得含水率为2%的熊胆粉成品，为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末。齐光伟建立了一种冰晶态的熊胆粉制备方法，将无管引流法采集的熊胆汁过滤得到滤液，用少量水稀释后，先后充入氮气和二氧化碳气体，然后进行深度冷冻，使熊胆汁处于一种冰晶状态，接着进行升华，由此所得冷冻干燥熊胆粉为玻璃样光泽的亮金黄色或鲜黄色粉末，显亮黄色荧光，吸湿率小于2%，水中溶解度大于10%，乙醇中的溶解度大于1.2%[21]。

以熊胆粉为原料，进一步处理制备不同的有效部位，可用于熊胆粉创新药物开发。取熊胆粉以水溶解或新鲜熊胆汁，用万级分子筛滤膜或超滤膜过滤，取沉淀，加水溶解，上葡聚糖凝胶柱，以水或缓冲溶液为洗脱溶剂分离，洗脱液冷冻干燥，得到熊胆大分子提取物，具有抗丙型肝炎病毒的作用，可用于开发治疗丙型肝炎药物[5-7]。将熊胆粉用乙醇回流提取，提取液回收乙醇浓缩后，再进行碱水解、中和酸化、乙酸乙酯提取、乙酸乙酯结晶、乙醇结晶，得熊胆粉总胆酸提取物，其中熊去氧胆酸的含量不低于70%，鹅去氧胆酸含量不高于20%，可用于开发抗菌、抗病毒、止咳化痰和保肝利胆药物[22]。采用乙醇对熊胆粉进行提取，制得熊胆醇提物，向熊胆醇提物中加入蒸馏水使溶解，制成熊胆水溶液，上大孔树脂柱，依次用蒸馏水、95%乙醇进行梯度洗脱，收集95%乙醇洗脱液，蒸干，得到熊胆树脂柱分离物，拌入硅胶，干燥，置于硅胶柱顶部，以氯仿-甲醇混合溶液为洗脱剂，进行硅胶柱梯度洗脱，收集体积比为4:1的氯仿-甲醇混合溶液为洗脱剂的洗脱液，蒸干，即得熊胆提取物，其中牛磺熊去氧胆酸的含量达到65%以上，能够有效地降低高脂饮食脂肪肝大鼠肝匀浆中甘油三酯和胆固醇的含量，在治疗脂肪肝方面具有良好的应用前景[23]。将熊胆粉醇提物制成水溶液，上大孔树脂柱，依次用蒸馏水、20%乙醇、40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液，蒸干，即得熊胆提取物，其中牛磺熊去氧胆酸的含量大于20%，牛磺鹅去氧胆酸的含量大于60%，可开发治疗烧烫伤的药物[24]。

5 熊胆粉质量控制技术

熊胆粉化学成分复杂，主要含有结合型熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、蛋白质、肽、游离氨基酸、磷脂、胆色素、胆固醇、脂肪酸和无机元素[25-26]，其中胆汁酸类成分被认为是其主要有效成分，熊去氧胆酸是其特有成分；大分子蛋白类成分具有高效抗丙型肝炎活性；磷脂、胆色素、胆固醇、氨基酸等成分也具有广泛的生理活性，对这些成分进行含量测定，有利于整体控制熊胆粉的质量。

熊胆粉的含量测定以及质量控制多以胆汁酸类成分为指标，卫生部颁布的新药转正标准中熊胆粉的标准分别使用了TLC法和HPLC-UV法对熊胆粉中的胆汁酸类成分进行了鉴别、检查和含量测定，规定含牛磺熊去氧胆酸不得少于23%。该标准中利用牛磺熊去氧胆酸的紫外末端吸收进行含量测定，图谱的基线易发生漂移，灵敏度较差，给测定工作带来困难，而利用HPLC-ELSD法能够解决这个问题，并且能够对熊胆粉中的牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸进行同时测定，测定方法具有较好的准确度与重现性，适用于熊胆粉的质量评价与控制[27-28]。磷脂是重要的生物活性物质，其主要成分磷脂酰胆碱(PC)具有改进肌体神经功能障碍及紊乱，恢复脑功能，增强记忆力以及抗衰老等功效。利用HPLC-UV法建立了熊胆粉中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)的含量测定方法，在15 min内完成测定，方法重复性较好，熊胆粉中PC、PI、PE的平均含量分别为3.6 mg/g、58.3 mg/g、3.9 mg/g[29]。文献报道[30]，利用酶标仪检测熊胆粉中胆红素含量为0.78%～1.89%，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质含量为6.41%～9.71%，用液相色谱质谱联用仪测定氨基酸含量为0.52%～2.12%，其中牛磺酸含量最高，为0.48%～1.97%，用电感耦合等离子体质谱仪测定微量元素，主要含有Ca、K、P、Na、Cu、Zn等元素。

为整体控制熊胆粉的质量，笔者课题组建立了熊胆粉HPLC-UV指纹图谱，并对熊胆粉中主要胆汁酸类成分牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸进行了含量测定，为熊胆粉的整体质量控制提供了方法[31-32]。测定黑宝药业生产的10批熊胆粉指纹图谱，确定19个共有峰，选择熊去氧胆酸峰为参照峰，利用相关系数法和夹角余弦法计算指纹图谱相似度均大于0.9，说明黑宝熊胆粉总体的化学组成一致性较好，质量稳定，可作为黑宝熊胆粉的专属性指纹图谱。质量跟踪研究显示，同一月内(每周取样一次)、同一年内(连续监测12个月份)以及不同年份产熊胆粉中两种胆汁酸类成分的含量都相对稳定，不随季节交替而产生变化，质量稳定。这也证明了在规范、科学的质量检测方法的监控下，通过规范化养殖管理，完全能够实现对熊胆粉生产质量的控制。

6 结论

熊胆粉是我国传统名贵中药，具有不可替代的特有药用价值，然而由于人工养熊及活体取胆备受争议，制约了熊胆粉的产业化发展。在国家法规的引导下，黑熊养殖技术和操作规范不断完善，无管无痛自体造瘘胆汁引流技术不断优化，人工养殖黑熊的福利问题得到解决，胆汁引流不影响黑熊健康和寿命，熊胆粉的加工技术先进，熊胆粉质量得到有效评价及控制，从而解决了我国熊胆粉的药用及其产业化的关键技术问题，更解决了野生资源利用和保护的矛盾，极大地推动了养熊业和熊胆粉产业发展，熊胆粉已进入规范、标准、可持续的产业化发展之路。